關于血紅蛋白的提取和分離含第一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三

本課題學習目標

簡述蛋白質提取和分離的基本原理，并了解凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2.主要原理：①凝膠色譜法分離蛋白質的原理②電泳法分離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法

4、課題難點：①樣品的預處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。第二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三1.分離生物大分子的基本思路：

選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。2.蛋白質分離和提取的原理：

根據蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附性質和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質?；A知識第三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三基礎知識（一）凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠：

大多數凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構成的多孔小球體，內部有許多貫穿的通道。

根據被分離的蛋白質相對分子質量的大小，利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，來進行分離。1.概念：3.凝膠色譜法的原理①當相對分子量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢;②而相對分子量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。③依據的特性是：蛋白質分子量的大小。第四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三4.凝膠色譜法分離蛋白質的原理和具體過程第五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三凝膠色譜法分離蛋白質過程的動畫演示

第六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三

（二）緩沖溶液

1.概念:

在一定的范圍內，凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:3.緩沖溶液的配制:

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內使用的緩沖液。

4.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:

利用緩沖液模擬細胞內的PH環境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察(紅色)和科學研究(活性)磷酸緩沖液第七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三

（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。第八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三

在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖第九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三聚丙稀酰胺凝膠電泳1、在測定蛋白質分子量時常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發劑和催化劑的作用下聚合交聯成的具有三維網狀結構的凝膠。第十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三

蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。2.原理：聚丙稀酰胺凝膠電泳

SDS能使蛋白質發生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。3.SDS作用機理:第十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三用SDS測定蛋白質分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據已知分子量的標準蛋白的電泳區帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數作標準曲線，可以測定未知蛋白質的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。第十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三血液血漿水分其他物質：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團2.血液有哪些成分？1.用雞的紅細胞提取DNA，用哺乳動物的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提??；人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白第十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三血紅蛋白兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團每個肽鏈環繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點：第十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三

二、實驗操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理：（一）蛋白質提取和分離步驟（二）操作過程

本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。(1)紅細胞的洗滌:①洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續血紅蛋白的分離純化，洗滌次數不可過少。②洗滌操作：

1、采集血樣。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。第十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三初次離心后的結果第十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三3次洗滌后的結果第十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：

①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

二、實驗操作第十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三(4)透析：

①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質。

二、實驗操作原理：透析袋能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內。第十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三透析過程動畫演示第二十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三利用透析袋透析第二十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。第二十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。第二十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三裝配好的凝膠柱第二十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。2、不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高第二十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三（3）樣品加入與洗脫

①調節緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續收集。（在分離過程中，如果紅色區帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環繞移動。第二十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環繞移動。第二十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三收集得到的純化后的蛋白第二十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期三思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩定的pH范圍內，維持結構和功能。

1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？

2、與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質得分離有什么意義？

血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經過透