電泳技術

在分子生物學中的應用電泳是帶電荷的膠體顆粒在電場中的移動。

凈電荷：生物大分子如蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒形式分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質的H+濃度與其他大分子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移，遷移的方向取決于它們帶電的符號。電泳的實現還依賴于支持介質的存在。電泳的三要素

以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質的區帶電泳法稱為凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳

（agrosegelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）凝膠電泳用于分離、鑒定和純化DNA片段重點內容影響DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率的因素有哪些？Westernblotting的基本實驗步驟,及每一步的操作意義.瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖（agarose）是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結構單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成直徑從50nm到略大于200nm的三維篩孔的通道。

凝膠的制備

以瓊脂糖為溶質，電泳緩沖液為溶劑，用微波爐加熱，配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框，插入梳子，自然冷卻。緩沖液系統

常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。

含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍

凝膠中的瓊脂糖含量[%（w/v）]線狀DNA分子的有效分離范圍（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2瓊脂糖濃度的選擇：根據被分離線狀DNA片斷的大小樣品配制與加樣

DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。

電泳

低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。因此，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，所用電壓不宜高于5V/cm。cm：電場正負極間的距離。

染色和拍照

常用熒光染料溴化乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統輸出照片，并進行有關的數據分析。

瓊脂糖凝膠中DNA的染色熒光染料溴化乙錠（EB）含有一個可以嵌入DNA或RNA的堆砌堿基之間的一個平面基團與核酸結合后在紫外線激發下呈現橘黃色熒光，熒光的位置代表核酸片段所在的位置，熒光的強弱代表核酸量的多少,可以檢測到少至10ng的DNA條帶。可用于檢測單鏈或雙鏈核酸（DNA和RNA）。

將已知分子量的標準DNA的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知DNA片段在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得其分子量。雙鏈DNA分子在凝膠基質遷移的速率與堿基對數目的常用對數成反比。雙鏈DNA分子在凝膠中的遷移率影響DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率的因素DNA分子的大小瓊脂糖濃度；DNA的構象：超螺旋環狀（I型）、切口環狀（II型）和線狀（III型）；共價閉環DNA＞直線DNA＞開環雙鏈DNA。當凝膠濃度太高時，凝膠孔徑變小，環狀DNA（球形）不能進入膠中，相對遷移率為0，而同等大小的直線DNA（剛性棒狀）可以按長軸方向前移，相對遷移率大于0。凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠;所用的電壓：低電壓時，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比；電場強度升高時，高分子質量片段的遷移率遂不成比例的增加；電泳緩沖液：組成和離子強度。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和

過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯接而形成凝膠.

與瓊脂糖凝膠電泳的比較,PAGE的特點分辨率很強，長度上相差1bp的DNA即可分開；從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可適用于要求最高的實驗（如胚胎注射）；裝載更多的DNA量；最適合分離小片段DNA(5-500bp),可以分離蛋白質;聚丙烯酰胺凝膠一律進行垂直電泳.假如DNA順序中的某個堿基發生了突變，使突變所在部位的DNA序列產生（或缺失）某種限制性內切酶的位點。這樣，利用該限制性內切酶消化此DNA時，便會產生與正常不同的限制性片段。這樣，在同種生物的不同個體中會出現不同長度的限制性片段類型，即限制性片段多態性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)。限制性片段多態性(RFLP)點多態性實驗方法1.DNA的提取2.PCR3.限制性內切酶酶解4.聚丙烯酰胺凝膠電泳分離5.染色SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）的原理在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，同時，在強還原劑（beta-巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合(多肽和SDS的質量比為1:1.4)，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，所帶的負電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差異。

蛋白質-SDS復合物的形狀近似于長的橢圓棒，它們的短軸是恒定的，而長軸與蛋白質分子量的大小成比例。因此，蛋白質-SDS復合物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳系統中的遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質亞基分子量的大小。當蛋白質分子量在15KD到200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系。特點大多在不連續緩沖體系中進行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強度不同于配膠緩沖液；不連續緩沖體系具有把樣品中的復合物全部濃縮于極小體積的能力，故提高了SDS的分辨力；系統中所有組分都含有0.1%的SDS。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）負極積層膠分離膠加樣孔正極配置積層膠分離膠丙烯酰胺濃度5%10-15%Tris-HCl1M，PH=6.81.5M，PH=8.8SDS，過硫酸銨，TEMED濃度相同電泳積層膠分離膠電壓80V120VTris-HCl-甘氨酸電泳緩沖液(pH8.3)在凝膠中的電離情況甘氨酸→帶負電的蛋白質亞基→Cl-帶負電的蛋白質亞基→甘氨酸-→Cl-被分離蛋白質亞基的電離情況蛋白質亞基由于甘氨酸的擠壓作用，在積層膠不被分離，而是被濃縮為最小體積蛋白質亞基在分離膠根據分子量的大小被分離

考馬斯亮藍染色(0.1-1.0ug的多肽)One-DimensionalSDSIsoelectricFocusing(IEF)

等電聚焦電泳的過程電泳時可將樣品置于凝膠的任何位置；初始位置在負極時，因pH＞pI，蛋白質分子帶負電，電泳時向正極移動；移動過程中，pH逐漸下降，所帶負電荷量逐漸減少，蛋白質移動速度減慢；當移動到pH=pI時，蛋白質所帶凈電荷為零，蛋白質即停止移動；各種不同蛋白質在電泳結束后，會分別聚集于相應的等電點位置，形成一個很窄的區帶；區帶的位置是由pH梯度的分布和蛋白質的pI所決定，而與蛋白質分子的大小和形狀無關。Two-DimensionalSDSPI(byisoelectricfocusing–IEF)Approximatemolwt.(bySDSPAGE)Exampleof2D-GelSeparationofProteins

2Dgelsareidealtoolsofproteinseparationbecauseoftheirhighresolution(>1000spotsarecommonlyvisualizedonasinglegel)andvisualreadoutWesternblotting印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法.對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法;對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法.WesternBlotting基本原理

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。1）蛋白提取2）SDS3）轉膜4）封閉5）一抗作用6）標記二抗作用7）結果檢測Westernblotting基本步驟：轉膜將凝膠和固相基質象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間。

正極三層濾紙硝酸纖維素濾膜凝膠三層濾紙負級

轉膜后檢測

麗春紅S染色預染蛋白marker

考馬斯亮藍染色封閉:膜上的空白位點脫脂奶粉（5％）BSA(牛血清白蛋白)