實(shí)驗(yàn)一、RNA提取方法及原理一、研究背景二、方法及原理一、研究背景1.RNA研究的重要性DNA，RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。二、方法及原理1、RNA的提取流程

（1）樣本前處理（2）細(xì)胞裂解（3）RNA的純化及獲得RNA提取流程－－樣品前處理注意點(diǎn)

選擇新鮮血液，不得超過4小時選擇新鮮的幼嫩組織選擇處于生長旺盛的時期收集細(xì)胞選擇新鮮組織，生長旺盛的組織可將新鮮血液先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，得到的白細(xì)胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存較長時間去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzol-70℃保存較長時間推薦使用專門的RNA樣品儲存液進(jìn)行儲存液氮或加入RNase抑制劑中保存，避免反復(fù)凍融RNA提取流程－－樣品前處理中如何保存樣本RNA提取流程－－

RNA的純化及獲得RNA純化要求1純化后不應(yīng)存在對酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)有抑制作用物質(zhì)2排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染3蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染2.RNA提取的注意事項(xiàng)杜絕外源酶的污染a.嚴(yán)格戴好口罩，手套。b.實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺面等要徹底處理。c.實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。阻止內(nèi)源酶的活性a.選擇合適的勻漿方法。b.選擇合適的裂解液。c.控制好樣品的起始量。Rnase污染的10大來源

1：手指頭2：槍頭3：水/緩沖液4：實(shí)驗(yàn)臺面5：內(nèi)源Rnase6：RNA樣品7：質(zhì)粒抽提8：RNA保存9：陽離子(Ca,Mg)10：后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶復(fù)習(xí)核酸的提取方法RNA的提取苯酚水溶液提取細(xì)胞破碎→勻漿等體積90％苯酚水溶液振蕩→RNA、Pro分開→RNA、多糖（水層）；DNA、Pro（苯酚層）冷酚法、熱酚法，注意苯酚除雜復(fù)習(xí)核酸的提取方法DNA提取濃鹽法：1mol/L氯化鈉溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)或：先用稀鹽除去RNA－Pro，再用濃鹽提取也可用苯酚法，苯酚層得到DNA、ProTrizol

試劑提RNA的原理Trizol

試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑。Trizol中含苯酚和異硫氰酸胍，可保護(hù)RNA免受RNase的污染。Trizol試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性，裂解細(xì)胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。TRIzol法提取流程1.樣品處理：

組織：取100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置勻漿器中，加入1mlTrizol充分勻漿，勻漿液轉(zhuǎn)1.5ml離心管中,室溫靜置５min。2.加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。3.4℃離心，13000g×15min，取上清。4.加入與上清1:1的異丙醇(約0.5ml)，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置20min(-20℃，時間長效果更好)。

取200-300ul從5步往下做。TRIzol法提取流程5.4℃離心，13000g×10min，棄上清。6.加入1ml75%乙醇，洗滌沉淀,將沉淀打碎。4℃，13000g×5min，棄上清。7.100%乙醇,輕輕洗滌沉淀.(不用將沉淀打碎)8.晾干，加入適量的H2O溶解（100ul）（65℃促溶10-15min）。9.定量。RNA提取常見問題

RNA的降解

OD260/OD280

比值偏低電泳帶型異常下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA降解

新鮮細(xì)胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品

(如脾臟，胸腺等)，很難避免

RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。RNA降解冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對小一點(diǎn)；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時補(bǔ)充液氮。OD260/OD280比值偏低抽提試劑殘留：確保洗滌時要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。解決辦法:再沉淀一次后，溶解。設(shè)備限制：測定OD260及OD280數(shù)值時，要使OD260讀數(shù)在0.10-0.50之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD時，對照及樣品稀釋液請使用10mM

Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。電泳帶型異常

非變性電泳：上樣量超