白細胞介素白細胞介素：白細胞介素即是由多種細胞產(chǎn)生并作用于多種細胞的一類細胞因子。目前至少發(fā)現(xiàn)了38個白細胞介素，分別命名為IL-1~IL38，功能復雜，成網(wǎng)絡，復雜重疊;在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調節(jié)等一系列過程中均發(fā)揮重要作用，此外它們還參與機體的多種生理及病例反應。白細胞介素的由來：白細胞介素（interleukin,IL）最初是指由白細胞產(chǎn)生又在白細胞間發(fā)揮作用的細胞因子，雖然后來發(fā)現(xiàn)白細胞介素可由其他細胞產(chǎn)生,也可作用于其他細胞，這一名稱仍被沿用。在1979年第二屆國際淋巴因子專題討論會上，白細胞介素將來自單核-巨噬細胞、T淋巴細胞所分泌的某些非特異性發(fā)揮免疫調節(jié)和在炎癥反應中起作用的因子稱為白細胞介素（interleukin，IL）。顯微鏡下的白細胞介素白細胞介素的分類IL-1：又稱淋巴細胞刺激因子。IL-2：又稱T細胞生長因子，TCGFIL-3：又稱為多能集落刺激因子（multi-csf）。IL-4：由抗原或絲裂原刺激的cd4+t細胞產(chǎn)年，活化的肥大細胞亦可產(chǎn)生il-4。IL-5：由抗原活化的cd4+t細胞產(chǎn)生；肥大細胞也能產(chǎn)生il-5。IL-6：可由多種細胞合成，包括活化的t細胞和b細胞、單核－巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞以及成纖維細胞等。白細胞介素的分類IL-7：il-7是由骨髓基質細胞分泌的糖蛋白，分子量為25kd；其基因位于第8號染色體。IL-8：il-8主要由單核－巨噬細胞產(chǎn)生；其他如成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞、肝細胞等亦可在適宜的刺激條件下產(chǎn)生il-8。IL-9：細胞來源：il-9主要是由th細胞產(chǎn)生，在人和實驗鼠的體內都可以自我合成。IL-10

1、細胞來源：il-10的分子量為35～40kd，通常為二聚體；主要由th2細胞產(chǎn)生，也可由單核細胞、角質細胞及活化的b細胞產(chǎn)生。

白細胞介素的分類IL-11：il-11由骨髓基質細胞產(chǎn)生，分子量約為23kd，是造血微環(huán)境中一個多功能的調節(jié)因子。IL-12：il-12主要由b細胞和巨噬細胞產(chǎn)生；其分子是一種異型二聚體，40kd（p40）和35kd(p35)的2個亞基通過二硫鍵相連接。IL-13:細胞來源：il-13由th2細胞產(chǎn)生，分子量約10kd；其基因位于第5號染色體上，與il-4基因緊密連接。il-13分子的氨基酸順序與il-4有20％～25％的同源性，在功能上也與il-4有許多相似之處。白細胞介素的分類IL-14;

il-14由t細胞分泌，其成熟形式含468個氨基酸殘基，可刺激活化的b細胞增殖，抑制絲裂原誘導的b細胞分泌免疫球蛋白。

IL-15

：il-15是新發(fā)現(xiàn)的一種因子，可由活化的單核－巨噬細胞、表皮細胞和成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生。白細胞介素2(IL-2)細胞來源：主要由T細胞產(chǎn)生。又稱T細胞生長因子。作用方式：以自分泌和旁分泌方式發(fā)揮效應。主要生物學功能：（1）活化T細胞，促進細胞因子產(chǎn)生（2）刺激NK細胞增殖，增強NK殺傷活性及產(chǎn)生細胞因子，誘導LAK細胞產(chǎn)生。（3）促進B細胞增殖和分泌抗體。白細胞介素2生產(chǎn)工藝流程發(fā)酵工程菌為大腸桿菌。種子用LB培養(yǎng)基；發(fā)酵用M9CA培養(yǎng)基，30℃10小時，后提高溫度至42℃，誘導3小時。分離純化包涵體制備：

離心收集，菌體懸于EDTA溶液中，用超聲波破碎細胞，后8000r/Min離心，收集沉淀（包涵體和細胞碎片）包涵體洗滌及裂解用Tris-HCL洗滌3次，離心收集沉淀，用鹽酸胍變性，離心收集上清液。凝膠過濾及復性：上清過SephacrylS-200柱，醋酸液洗脫，收集洗脫峰。干燥：冷凍真空干燥。目標基因克隆研究內容研究方法PCR，文庫，化學合成表達載體構建遺傳轉化與篩選工程菌酶切，連接外源基因導入與培養(yǎng)新性狀、功能、物質工程菌構建流程工程菌構建的目標獲得質粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達的載體，確保藥物的生物活性。大

腸

桿

菌

構

建

技

術大腸桿菌細胞：G－，單細胞，桿狀。鞭毛、無芽孢、一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑2－3mm。大腸桿菌構建技術1.PCR擴增PCR(Polymerasechainreaction)聚合酶鏈式反應：在DNA聚合酶催化下，對特定的DNA序列進行的復制反應本質：生物體DNA復制原理在體外合成DNA

發(fā)明者：Mullis，生物技術革命的象征，1993年獲得諾貝爾獎2.酶切反應

概念：在特異位點上催化dsDNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應的限制性片段。酶切體系組成：目標和質粒DNA，緩沖液，限制性內切酶。反應條件：適宜溫度(37℃)，1小時以上。終止反應：加熱；加入EDTA，螯合鎂離子。電泳檢查：酶切完全性。3.連接反應概念：DNA雙鏈上相鄰的3′-羥基和5′-磷酸基因共價結合形成3′-5′-磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。連接體系：載體片段與基因片段，緩沖液，連接酶。連接反應：16℃-26℃，數(shù)小時，或過夜。終止反應：在70℃加熱10分鐘。4.轉化轉化：把外源基因導入宿主細胞的過程；某一基因型細胞從周圍介質中吸收另一基因型細胞的DNA，使其基因型和表型發(fā)生相應變化的現(xiàn)象

大腸桿菌轉化法-CaCl2法

感受態(tài)細胞制備：將培養(yǎng)液轉入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4℃下離心10分鐘。棄去上清，用預冷的0.05mol/L的CaCl2

溶液10ml輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30分鐘后，4℃下，離心10分鐘。加入連接反應產(chǎn)物：混勻，置冰上30分鐘。熱擊：42℃，90s；置冰上，1－2分鐘。擴增培養(yǎng)：加入LB培養(yǎng)基，37℃，45分鐘。涂平板：含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)：37℃，出現(xiàn)菌落。

5.篩選與鑒定轉化后的細胞類型

非轉化子：沒有導入外源DNA的非轉化宿主細胞轉化子：導入外源DNA的轉化細胞非重組子：僅含有空載體分子的轉化子重組子：含有重組DNA分子的轉化子目標重組子：含有連接正確的重組分子（目的）非目標重組子：不含目的基因重組子篩選方法抗生素篩選法：抗生素的抗性基因|氨芐青霉素篩選方法籃白斑篩選法：lacZ基因，重組子白色，非重組子藍色。培養(yǎng)基中含X-galX-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷β-半乳糖苷酶可以把培養(yǎng)基中無色的X-gal分解成半乳糖和呈藍色的5-溴-4-氯-靛藍，使菌落成藍色鑒定方法

菌落PCR：含有目標基因載體大小：電泳檢測酶切鑒定：目標基因插入及插入方向測序確證：目標基因的序列準確無誤工程菌構建的質量控制為了確保工程菌構建的有效性，必須遵循GMP及其有關生物制品研究技術指導原則，做好菌種的紀錄和管理。溫度對工程菌產(chǎn)物合成的影響生長與生產(chǎn)溫度不一致較高溫度表達量達，易形成包涵體策略：較低溫度下有利于表達可溶性蛋白質對于熱敏感的蛋白質，高溫會降解破壞策略：生產(chǎn)期可采用先高溫，后低溫，變溫表達，避免蛋白質降解例如：

大腸桿菌和酵母生長最低溫度為10℃

大腸桿菌生長最適溫度為37℃，最高溫度為45℃

釀酒酵母：生長最適溫度為30℃，最高溫度為4