教學(xué)對象：高等醫(yī)學(xué)院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學(xué)生試驗課時：8課時課程類型：專業(yè)試驗課課程要求：必修每組人數(shù)：2人水微生物檢測專家講座第1頁試驗?zāi)繕?biāo)與要求掌握水樣采集規(guī)則及注意事項。熟悉慣用水衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)指標(biāo)。熟悉菌落總數(shù)、大腸菌群測定方法及檢測意義。學(xué)會對所檢測水樣作綜合分析。水微生物檢測專家講座第2頁水微生物檢測意義水體微生物污染問題日趨嚴(yán)重。在各種水體，尤其是污染水體中存在有大量有機(jī)物質(zhì)，適于各種微生物生長。水體中微生物污染起源：土壤，以及人類、動物排泄物污染。水體中少數(shù)致病微生物（主要來自人或動物糞便污染）可造成一些腸道傳染病傳輸。水微生物檢測可用于評價水質(zhì)情況，預(yù)報水質(zhì)污染趨勢，以確保水質(zhì)衛(wèi)生安全。水微生物檢測專家講座第3頁在實(shí)際工作中，對水質(zhì)衛(wèi)生質(zhì)量評價和控制，是無法對水體中各種可能存在致病微生物一一進(jìn)行檢測。普通選擇有代表性一個或一類微生物作為指示菌，經(jīng)過對指示菌檢測，來了解水體是否受到過微生物污染，是否有腸道病原微生物存在可能。水微生物檢測專家講座第4頁水微生物檢測指標(biāo)菌落總數(shù)(aerobicbacterialcount)是指1ml水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長細(xì)菌菌落總數(shù)。檢測意義：作為普通性污染指標(biāo)，即評價被檢樣品微生物污染程度和安全性。水樣菌落總數(shù)越多，說明水被微生物污染程度越嚴(yán)重，病原微生物存在可能性越大，但不能說明污染起源。水微生物檢測專家講座第5頁水質(zhì)微生物檢測指標(biāo)總大腸菌群(coliformbacteria)是指一群需氧及兼性厭氧，37℃生長時能使乳糖發(fā)酵，在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣革蘭氏陰性無芽胞桿菌。檢測意義：作為糞便污染指標(biāo)。水樣總大腸菌群數(shù)含量，表明水被糞便污染程度，而且間接地表明有腸道致病菌存在可能。水微生物檢測專家講座第6頁試驗內(nèi)容水樣采集；菌落總數(shù)測定；總大腸菌群測定。水微生物檢測專家講座第7頁一、水樣采集水微生物檢測專家講座第8頁采樣標(biāo)準(zhǔn)所采集樣品含有代表性。采樣容器：選擇硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。不能是新污染源；不吸收或吸附一些待測組分；不與待測組分發(fā)生反應(yīng)。確保從采樣到分析期間，樣品各組分濃度不發(fā)生改變。必須按普通無菌操作基本要求采集，并確保在運(yùn)輸、貯存過程中不受污染。水微生物檢測專家講座第9頁自來水水樣：先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再開放水龍頭使水流5min（經(jīng)慣用水水龍頭放水1～3min）后，采集水樣于無菌錐形瓶，約占瓶容量80%，方便搖勻水樣。水源水水樣：選有代表性地點(diǎn)及可疑地方，普通距水面下10～15cm采樣。采樣后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。水微生物檢測專家講座第10頁注意事項嚴(yán)格無菌操作。做好標(biāo)識：采得水樣后應(yīng)馬上統(tǒng)計水樣名稱、地點(diǎn)、時間等項目。從速送檢。水樣從采集到檢驗不應(yīng)超出2h，在0～4℃下保留不應(yīng)超出24h。水微生物檢測專家講座第11頁二、菌落總數(shù)測定—平板菌落計數(shù)法水微生物檢測專家講座第12頁（一）生活飲用水[器材與試劑]

無菌1ml吸管1支/組，無菌平皿3個/組，營養(yǎng)瓊脂。水微生物檢測專家講座第13頁[方法]水樣搖勻20~25次，使細(xì)菌分散。傾注培養(yǎng)：無菌吸收1ml水樣分別置于2個空平皿，另一個作空白對照。再傾注15ml瓊脂（約45℃）于平皿中旋轉(zhuǎn)，混勻待瓊脂凝固后倒置37℃24h。菌落計數(shù)：用肉眼或放大鏡檢驗，計數(shù)平皿內(nèi)菌落數(shù)目。水微生物檢測專家講座第14頁[結(jié)果分析與匯報]計算平均菌落數(shù)：匯報方式：菌落總數(shù)(cfu/ml)。cfu：colonyformingunits當(dāng)檢樣菌落數(shù)為l~100時，按實(shí)有數(shù)匯報；大于100時，采取二位有效數(shù)字匯報。國家標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-）要求生活飲用水菌落總數(shù)每毫升不得超出100個。水微生物檢測專家講座第15頁（二）水源水[器材與試劑]

無菌1ml吸管6支/組，無菌10ml吸管1支/組。無菌平皿9個/組，營養(yǎng)瓊脂。90ml滅菌鹽水1瓶（內(nèi)置適量玻璃珠），9ml滅菌鹽水管3支。水微生物檢測專家講座第16頁[方法]

稀釋水樣：無菌吸10ml混勻水樣注入90ml滅菌水瓶中,混勻成1:10水樣。取1:10水樣1ml注入9ml滅菌試管中混勻成1:100水樣。同法稀釋成1:1000,1:10000水樣。水微生物檢測專家講座第17頁[方法]

傾注培養(yǎng)：用1ml無菌吸管吸收2~3個適當(dāng)濃度稀釋液1ml,分別注入無菌平皿中，每個稀釋度應(yīng)同時做2個平皿，另取一平皿作空白對照。再做傾注培養(yǎng)(方法同飲用水)。菌落計數(shù)：方法同飲用水。水微生物檢測專家講座第18頁菌落總數(shù)測定水微生物檢測專家講座第19頁[結(jié)果分析與匯報]計算不一樣稀釋度平均菌落數(shù)：稀釋度選擇和菌落總數(shù)匯報方式：首先選擇平均菌落在30～300之間者進(jìn)行計算。計算方法和匯報方式如表1所表示。水微生物檢測專家講座第20頁表1稀釋度選擇及菌落總數(shù)匯報方式例次不一樣稀釋度平均菌落數(shù)兩稀釋度菌落總數(shù)之比

菌落總數(shù)(cfu／m1)匯報方式(cfu／m1)10-110-210-312345678136527602890150多不可計27多不可計01642952713046501l305020466085135120—1.62.22————164003775027100150051300027030500<1×1016000或1.6×10438000或3.8×10427000或2.7×1041500或1.5×103510000或5.1×105270或2.7×10231000或3.1×104<10水微生物檢測專家講座第21頁由表2可判定水質(zhì)被污染程度。表2普通水源水中菌落總數(shù)與水清潔程度關(guān)系

水類別最清潔水清潔水不太清潔水不清潔水極不清潔水菌落總數(shù)

cfu／m110~100100~10001000~1000010000~100000＞100000水微生物檢測專家講座第22頁[注意事項]菌落總數(shù)測定中，應(yīng)選擇適當(dāng)稀釋度進(jìn)行。（生活飲用水，國家標(biāo)準(zhǔn)要求每毫升不得超出100個，所以能夠直接吸收1毫升到平板進(jìn)行培養(yǎng)）各稀釋管、對應(yīng)平皿做好標(biāo)識。包含：水樣名稱、稀釋度、時間、小組。嚴(yán)格無菌操作。進(jìn)行水樣稀釋時，每一稀釋度均需更換吸管。傾注時，要注意營養(yǎng)瓊脂溫度。傾入瓊脂后要混勻，待瓊脂凝固后倒置培養(yǎng)。水微生物檢測專家講座第23頁三、總大腸菌群測定

—多管發(fā)酵法分為三步：初發(fā)酵試驗平板分離復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗水微生物檢測專家講座第24頁初發(fā)酵試驗：采取乳糖蛋白胨培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。平板分離：對陽性管培養(yǎng)物，接種于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，觀察菌落特征，并進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗：對經(jīng)典和可疑菌落，接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，進(jìn)行復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)所附檢數(shù)表匯報結(jié)果。水微生物檢測專家講座第25頁產(chǎn)氣初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵試驗結(jié)果水微生物檢測專家講座第26頁大腸菌群EMB上菌落特征水微生物檢測專家講座第27頁大腸菌群革蘭染色形態(tài)水微生物檢測專家講座第28頁（一）生活飲用水[器材與試劑]2瓶50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（內(nèi)有導(dǎo)管）,10支5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（內(nèi)有導(dǎo)管）,10ml吸管1支,100ml量筒1支。EMB，革蘭染液等。水微生物檢測專家講座第29頁[方法]

初步發(fā)酵試驗：接種水樣總量為300ml（100ml2份，10ml10份，12支發(fā)酵管）。37℃培養(yǎng)24h。平板分離：將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(發(fā)酵乳糖)管接種EMB,37℃培養(yǎng)24h，取經(jīng)典菌落作革蘭氏染色鏡檢。復(fù)發(fā)酵試驗：革蘭氏染色鏡檢為革蘭陰性無芽胞桿菌，取該菌接種于普通濃度乳糖蛋白胨(每管接1~3個菌落),37℃培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即證實(shí)有大腸桿菌存在。

水微生物檢測專家講座第30頁產(chǎn)酸產(chǎn)氣匯報為大腸菌群陽性水微生物檢測專家講座第31頁[結(jié)果分析與匯報]依據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在陽性管（瓶）數(shù)，查接種水樣總量為300ml檢數(shù)表（表3）。匯報每升水樣中大腸菌群數(shù)（MPN值，MostProbableNumber，最大可能數(shù)法）。國家標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-）要求生活飲用水大腸菌數(shù)每升不得超出3個。水微生物檢測專家講座第32頁表3大腸菌群數(shù)檢數(shù)表

接種水樣總量300ml（100ml2份，10ml10份）10ml水量陽性管數(shù)100ml水量陽性管數(shù)012每升水樣中大腸菌群數(shù)每升水樣中大腸菌群數(shù)每升水樣中大腸菌群數(shù)0l2345678910＜33711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230＞230水微生物檢測專家講座第33頁（二）水源水[器材與試劑]1ml吸管3支/組，10ml吸管1支/組，10ml普通發(fā)酵管（內(nèi)有導(dǎo)管）3支/組，5ml三倍發(fā)酵管（內(nèi)有導(dǎo)管）1支/組。EMB，革蘭染液等。水微生物檢測專家講座第34頁[方法]稀釋水樣：水樣做1:10及1:100稀釋。方法同菌落總數(shù)測定。初發(fā)酵試驗：接種水樣總量11.11ml，4支發(fā)酵管。取10ml原水樣注入5ml三倍乳糖發(fā)酵管（內(nèi)有導(dǎo)管）；取1ml原水樣、1ml1:10及1:100稀釋水樣分別注入10ml普通乳糖發(fā)酵管（內(nèi)有導(dǎo)管），37℃培養(yǎng)24h。平板分離與復(fù)發(fā)酵試驗：同生活飲用水。水微生物檢測專家講座第35頁[結(jié)果分析與匯報]依據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在陽性管（瓶）數(shù)，查接種水樣總量為11.11ml檢數(shù)表（表4），匯報每升水樣中大腸菌群數(shù)。水微生物檢測專家講座第36頁表4大腸菌群數(shù)檢數(shù)表

接種水樣總量11.11ml（10ml、1ml、0.1ml、0.01ml各1份）接種水樣總量(ml)每升水樣中大腸菌群數(shù)1010.10.01－－－－－－－＋－－－＋－＋＋－－＋＋－＋－－－－＋＋－－－＋＋－＋＋－－－＋＋－＋地＋－＜９０９０９０９５１８０１９０２２０２３０２８０９２０９４０水微生物檢測專家講座第37頁[注意事項]總大腸菌群測定方法，因為飲用水和水源水可能污染程度不一樣，因些采取不一樣接