發育生物學五周簡第1頁/共64頁一、程序性細胞死亡PCD（programmedcelldeath）又稱細胞凋亡

(apoptosis)（在體內外因素誘導下，由基因嚴格調控而發生的自主性細胞有序死亡。）1、概念一個固有的遺傳程序即生物鐘，在一個受控制的時間和空間內激活，從而導致細胞死亡。第2頁/共64頁細胞凋亡與程序性細胞死亡

意義大致相同，二者可交互使用。比較說來程序性細胞死亡側重于發育學功能上描述；強調死亡發生的時間；適用于胚胎細胞。細胞凋亡偏重于病理形態描述；強調細胞死亡的方式；適用于所有細胞。第3頁/共64頁蝌蚪尾的消失脊椎動物的神經系統的發育發育過程中手和足的成形過程第4頁/共64頁2、簡史1885年，Flemming第一個描述有關細胞凋亡的特征；（染色質濃縮形成半月形）1914年，Graper用這種死亡現象解釋胚胎發育中器官收縮等現象1951年，Glucksmann發現在胚胎發育中存在這種死亡，并詳細描述；60年代，Lockshin和Williams首次提出‘‘程序性細胞死亡’’這一概念第5頁/共64頁1986年，Robert

Horvitz等發現線蟲中ced3（caspase），ced4（Apaf-1）是促凋亡基因。1980年，Wyllie等發現細胞凋亡與內源性核酸內切酶激活有關。

“DNAladder”是細胞凋亡發生的標志；1965年，JohnKerr提出“固縮性壞死”概念；1972年，Kerr，Wyllie，Currie提出“細胞凋亡”（apoptosis）的概念；第6頁/共64頁二、PCD/細胞凋亡的形態變化(1)細胞皺縮變圓，微絨毛、復合體消失；出芽(budding)膜空泡化（blebbing)(2)胞質濃縮、細胞器結構保留(3)核濃縮；染色質凝聚(4)凋亡小體形成胞膜皺縮內陷，分割包裹胞質(內含DNA物質及細胞器)，形成的膜包顆粒即凋亡小體（apoptosisbody）

(5)吞噬第7頁/共64頁三、PCD/細胞凋亡的生理和生化變化磷脂酰絲氨酸外翻：annexinV基因轉錄和蛋白質合成：

與細胞骨架降解有關的酶谷胱甘肽轉移酶、組織蛋白酶D、組織型纖維蛋白酶原激活劑等

與細胞和凋亡小體形態維持有關的蛋白質

簇因子、r-谷丙轉氨酶等Ca2+、Mg2+依賴性的核酸內切酶活化：降解DNA，形成180-200bp或其倍數的DNA片段第8頁/共64頁PCD/細胞凋亡與壞死的區別★第9頁/共64頁細胞壞死(necrosis)

指由于某些外界毒性刺激（如局部缺血、高熱、物理和化學損傷或生物的侵襲等），直接作用于細胞導致的細胞急速死亡，一般伴有炎癥反應。

一般過程：因補體反應或烈性病毒感染破壞了質膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進入細胞，從而導致細胞吸水膨脹，最終破膜而死。第10頁/共64頁細胞凋亡與細胞壞死是多細胞生物細胞死亡的兩種不同形式，在形態學、生化代謝、分子機制、結局和意義等方面都有本質的區別。

細胞壞死特征：溶酶體釋放酶，細胞器瓦解，細胞骨架降解，細胞核破裂、降解，蛋白質合成終止，由于膜破裂，出現炎癥反應第11頁/共64頁細胞壞死細胞凋亡1.性質病理性生理性或病理性2.誘導因素強烈刺激，隨機發生較弱刺激，非隨機發生3.生化特點被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能4.形態變化細胞腫脹、細胞結構全面溶解、破壞胞膜及細胞器相對完整，細胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈梯狀條帶6.炎癥反應溶酶體破裂，局部炎癥反應溶酶體相對完整，局部無炎癥反應7.凋亡小體無有8.基因調控無有表8－1細胞凋亡與細胞壞死的比較第12頁/共64頁三、胚胎發育中的程序性細胞死亡（PCD）

（一）PCD參與了各器官的形態發生和發育。1、肢體的發生2、中樞神經系統的發生、發育3、腭的發生4、管（腔）道的形成5、晶狀體的發育6、心的發育7、生殖細胞的發生8、免疫、造血系統的發生9、無用結構的退化消失（弓動脈、前腎、中腎、尾芽、鰓膜等）第13頁/共64頁實驗將17期的雞胚翅芽后緣的細胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節中，發育至24期時仍發生死亡。將17期的雞胚翅芽后緣以外的細胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節中，發育至24期時不發生死亡。

證明雞胚翅芽后緣細胞的死亡有著預定的時間和空間程序。第14頁/共64頁（二）胚胎發育中PCD的意義1、系統匹配淘汰沒有作用或不再起作用的細胞，以確保有功能細胞的營養和空間。2、除去短暫結構：人胚尾芽3、雕刻軀體從而形成正常、精細復雜的生物體。4、保護機體：如胸腺的發育、損傷的胚胎細胞第15頁/共64頁四、PCD/細胞凋亡的調節（一）激素水平的調節：甲狀腺素（蝌蚪）、糖皮質激素（胸腺cell）、苗勒抑制物質（中腎旁管）等誘導PCD雌激素及卵泡刺激素（顆粒細胞）、胰島素（晶狀體上皮細胞）等抑制PCD（二）細胞因子調節主要是生長因子：NGF，FGF，TGF，G-CSF等缺乏導致PCD第16頁/共64頁（三）PCD相關基因/蛋白的調節1、TNF死亡受體超家族（1）死亡受體：Fas、TNFRI等（2）與死亡受體有關的含死亡結構域的信號蛋白：FADD（FAS相關死亡蛋白）、TRADD（TNFRI相關死亡蛋白）等第17頁/共64頁（1）死亡受體：Fas、TNFRI等結構特點：

胞內C-端：胞內功能區由80個氨基酸構成的死亡結構域（deathdomain，DD）

跨膜區

胞外N-端：胞外功能區內含數個半胱氨酸第18頁/共64頁（2）含有死亡結構域的信號蛋白TRADD（TNFR相關死亡蛋白）：34kD，C端的DD與TNFRI，FADD的DD結合FADD（Fas相關死亡蛋白）

（MORT-1）：23kD，C-端含有一個DD(deathdomain)，可與Fas結合；N-端含有

MORT結構域或死亡效應結構域（DED:deatheffectordomain），可與

proCaspase-8（FLICE）的DED結合第19頁/共64頁Fas(Apo-1,CD95):43kD

（三聚體FasL-----Fas------FADD（Fas相關死亡蛋白）--------proCaspase-8）(

DISC/死亡誘導信號復合物):活化Bid、caspase-3

DED:deatheffectordomainTNFRI（TNFR55）：55-60kD，TNFRI-------TRADD（TNFR相關死亡蛋白）------FADD--------proCaspase-8

DDDEDDDDDDED第20頁/共64頁Fas/FasLDD:deathdomain第21頁/共64頁凋亡誘導因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達、結合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD第22頁/共64頁2.凋亡蛋白酶Caspase:

cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天冬氨酸特異蛋白水解酶）一組對底物的天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。(1)定義第23頁/共64頁（2）Caspase的分類及功能凋亡啟動亞類(DED、CARD)凋亡效應亞類細胞因子加工亞類（ICE亞類）第24頁/共64頁Caspases激活的瀑布學說(級聯反應)第25頁/共64頁(3)結構特征①以無活性的酶原形式存在；②N端均含有一段前區域（內含DED、CARD)；CARD:CaspaseActivationandRecruitmentDomain第26頁/共64頁④在大亞基的C端含有一活性中心，其中半胱氨酸是必需氨基酸。③活性形式由2個大亞基和2個小亞基組成的雜四聚體；ActiveenzymeCatalyticsites第27頁/共64頁(4)

Caspase的作用底物

①凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD)CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶(具有內切酶活性)ICADCADDNACaspase第28頁/共64頁②核纖層（lamina）蛋白細胞核lamina染色體第29頁/共64頁③細胞骨架蛋白：導致細胞解體，形成凋亡小體

④其他的caspases⑤滅活細胞凋亡的抑制物第30頁/共64頁3、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1)

130kD，N-端含有一半胱氨酸蛋白酶募集域（CARD），C-端由12個WD-40重復片段組成。凋亡體/死亡復合體：Cytc-Apaf-1-dATP

（閉合的單體聚合成開放的七聚體）Cytc-Apaf-1-dATP-proCaspase-9第31頁/共64頁凋亡復合體CARD:Caspase ActivationandRecruitmentDomain第32頁/共64頁4、線粒體膜間隙蛋白（線粒體釋放的凋亡相關因子）細胞色素C，凋亡誘導因子，Apaf-1,Ca2+,

Smac/DIABLO等5、自由基活性氧自由基（超氧陰離子自由基、羥自由基及單線態氧，H2O2等）：誘導PCD的發生。活性氮自由基：NO—高濃度促PCD，低濃度抑制PCD第33頁/共64頁6、P53基因阻滯細胞G1期，修復受損的DNA，如修復失敗則通過多種途徑誘導細胞凋亡。（射線、毒素）分子警察第34頁/共64頁P53的促凋亡機制：（1）DNA結合蛋白，調控基因（BAX等)轉錄（細胞核途徑）（2）激活線粒體途徑（3）誘導Fas增加（4）誘導溶酶體的不穩定性第35頁/共64頁7、BcL-2家族3個亞家族抗凋亡蛋白亞家族（BcL-2亞家族）含多區域的促凋亡蛋白亞家族（Bax亞家族）僅含BH3區域的促凋亡蛋白亞家族（BH3亞家族）基本結構特征：跨膜結構域

BcL-2同源結構域（BH）第36頁/共64頁第37頁/共64頁第38頁/共64頁

BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族通過蛋白與蛋白相互作用調節著細胞的存活與凋亡。第39頁/共64頁第40頁/共64頁Bcl-2（B

celllymphoma/leukemia-2）

：

Bcl-2

是第一個被確認有抗凋亡作用，由229aa構成（鼠236）分布在線粒體膜,內質網，核膜等處。

Bcl-2

和C.elegans

中的ced-9

有很高的同源性，具有促進細胞存活的功能。第41頁/共64頁BcL-2抗凋亡機制：①直接抗氧化；②調節PTP（線粒體通透性轉換孔）開放；③抑制Bax，Bak的促凋亡作用；④抑制Caspases激活；⑤維持細胞鈣穩態。第42頁/共64頁8、凋亡抑制蛋白家族（IAP家族）

IAP家族是一組抑制凋亡的蛋白。IAP家族蛋白的主要結構域：BIR

（baculoviralIAPrepeat),鋅指結構域、CARD。BIR2是IAP

抑制凋亡的結構基礎。作用機制：抑制caspase-3,7,9等的活性。第43頁/共64頁Figure1SchematicdiagramofdomainstructureinrepresentativeIAPs第44頁/共64頁凋亡細胞DNA的斷裂形成高分子量的DNA大片斷（50kb)形成180－200bp整數倍的DNA小片斷非Caspase依賴的內源性核酸內切酶的激活Caspase依賴的內源性核酸酶激活(CAD)9.核酸內切酶第45頁/共64頁

Caspase8

Caspase3

Caspase9

Cleavageofsubstrates

Nucleus

DegradationofDNACAD激活方式細胞膜第46頁/共64頁DNA斷裂與“梯狀條帶”第47頁/共64頁第48頁/共64頁（二）、PCD的主要途徑1.膜受體通路(死亡受體通路/外源性通路)腫瘤壞死因子死亡受體(TNFR)家族中的死亡受體：Fas／CD95，TNFR第49頁/共64頁Fas/FasLDD:deathdomain第50頁/共64頁死亡受體通路凋亡誘導因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達、結合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD第51頁/共64頁2.線粒體通路（內源性途徑）線粒體通透性轉換孔（MPTP）：由內膜的腺苷轉位因子和外膜的電壓依賴性陰離子通道）構成的蛋白復合體。第52頁/共64頁第53頁/共64頁1、線粒體跨膜電位（Δψm）的破壞與細胞凋亡的一致性；

Δψm下降時PTP開放導致細胞凋亡

Δψm正常時無細胞凋亡

2、線粒體跨膜電位（Δψm）的破壞早于核DNA的斷裂。第54頁/共64頁??線粒體信號通路smacSmac:secondmitochondria-derivedactivatorofcaspaseIAPs(-)ApoptosisinducingfactorInhibitorsofapoptosisproteinapoptoticproteaseactiviationfactor第55頁/共64頁凋亡誘導因素死亡受體/配體的表達、結合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisBid活化線粒體通路活化死亡受體通路與線粒體通路的