前言EGFP基因的克隆及表達_第1頁
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前言EGFP基因的克隆及表達第1頁/共8頁綠色熒光蛋白(green-fluorescentprotein,GFP)是從太平洋水母中分離出來的一種熒光蛋白質,為238氨基酸組成的單體,分子量約為27kD。其野生型(wild-typeGFP)的吸收/激發峰在395nm,在475nm有一個次要峰，發射峰為508nm。對細胞無毒，用于轉基因表達的檢測。綠色熒光蛋白(GFP)第2頁/共8頁GFP的應用特點：1、檢測方便：不需要外加底物和輔助因子，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對于單細胞水平的表達也可識別。2、熒光穩定：GFP對光漂白有較強的耐受性，能耐受長時間的光照；在pH范圍在7-12之間都能正常發光；對高溫、堿、離子除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數普通酶都有較強抗性。3、無毒害：GFP對生活的細胞基本無毒害,對目的基因的功能也沒有影響,轉化后細胞仍可連續傳代。4、具有共用性和通用性：首先表現在GFP的表達幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達；其次是GFP沒有細胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達發出熒光。5、易于構建載體：由于GFP分子量較小，僅為27-30kD，編碼GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起構建多種質粒。6、可進行活細胞定時定位觀察。于得到突變體。第3頁/共8頁關于EGFP蛋白pEGFP-N3質粒編碼EGFP蛋白，它是野生型綠色熒光蛋白（wtGFP）經克隆技術改造而成的遺傳突變體。它有兩個氨基酸的替換，即Phe264→Leu和Ser265→Thr。用485nm光激發時，EGFP可以產生比wtGFP強35倍的熒光。另外，EGFP具有紅外轉換激發光譜（red-shiftedexcitationspectra），而且能在哺乳動物細胞內得到高水平表達。第4頁/共8頁質粒pEGFP-N3圖譜第5頁/共8頁表達載體pET-28apET表達體系是在大腸桿菌中克隆和表達融合蛋白常用的體系之一。使用T7Lac啟動子；BamHI下游存在轉錄終止信號；含有寡聚組氨酸鏈（His-tag),便于融合蛋白的純化。第6頁/

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