關于食品與蛋白質工程第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日概述

蛋白質是對生命至關重要的一類生物大分子物質，各種生命功能、生命現象、生命活動都和蛋白質有關。在生命有機體催化、運動、結構、識別和調節等許多方面，起著關鍵的作用。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日酶.幾乎全都是蛋白質。肌肉收縮、精子移動、細胞分裂過程中的染色體移動.高等生物的有序生長和分化過程。抗體蛋白能識別和結合特異性的外源物質，使人體具備抵抗各種細菌、真菌和病毒的能力。由神經細胞膜蛋白構成的離子通道，負責神經沖動的形成和傳導。血紅蛋白具有結合和釋放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氫離子的攜帶者。另外，人體的毛發和指甲屬于角蛋白，而血栓是由血纖蛋白單體聚合而成的。第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日蛋白質的生物學功能1.催化功能：酶2.調節功能：激素3.結構功能：皮、毛、骨、牙、細胞骨架4.運輸功能：血紅蛋白5.免疫功能：免疫球蛋白6.運動功能：鞭毛、肌肉蛋白7.儲藏功能：酪蛋白8.生物膜功能：及神經傳導等第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日

蛋白質是生命的體現者，離開了蛋白質，生命將不復存在。可是，生物體內存在的天然蛋白質，有的往往不盡人意，需要進行改造。由于蛋白質是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質有自己獨特的氨基酸順序，所以改變其中關鍵的氨基酸就能改變蛋白質的性質。而氨基酸是由三聯體密碼決定的，只要改變構成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能達到改造蛋白質的目的。蛋白質工程的一個重要途徑就是根據人們的需要，對負責編碼某種蛋白質的基因重新進行設計，使合成的蛋白質變得更符合人類的需要。

第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日第一節概述一、蛋白質工程的涵義

1.狹義：指通過改造與蛋白質相應的基因中的堿基順序，或設計合成新的基因，將它克隆至受體細胞中，通過基因表達而獲得具有新的特性的蛋白質（酶）技術。

2.廣義：P56這是一門從改變基因入手，定做新的蛋白質的技術。故有人將其稱為“第二代基因工程”1983年，美國生物學家額爾默（Ulmer）首先提出了“蛋白質工程”的概念。第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日根據需要合成具有特定氨基酸序列和空間結構的蛋白質；確定蛋白質化學組成、空間結構與生物功能之間的關系；從氨基酸序列預測蛋白質的空間結構和生物功能，設計合成具有特定生物功能的全新蛋白質。

二、蛋白質工程研究的主要內容第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日三、理性分子設計和非理性分子設計1.理性分子設計：在已知蛋白質結構與功能的基礎上，利用改變基因中某個或某些特定核苷酸的序列，對最可能影響蛋白質功能與性質的基因序列進行定位突變，有目的地改變蛋白質的某一兩個氨基酸殘基或模塊，從而構建全新的蛋白質分子的技術。（P57）第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日2.非理性分子設計：在不清楚蛋白質三維結構和作用機制的情況下，在實驗室條件下模擬自然進化的過程，在一定條件下使基因發生大量變異，然后通過多輪高通量的篩選方法定向選擇出所需要的特性突變我，得到具有預期新蛋白質的技術。（P57）第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日四、蛋白質工程的應用1.提高酶的穩定性2.提高酶的活力3.改變酶的選擇性第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日改變酶的催化活性酪氨酰tRNA合成酶Thr5151Pro改造活力25倍改變酶的專一性枯草桿菌蛋白酶活性中心枯草桿菌蛋白酶活性中心SerCys改造（水解蛋白質）水解硝基苯酯專一性改變第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日通過引入“工程二硫鍵”穩定溶菌酶構成活性中心的兩個結構域的相對位置，增強酶的穩定性；定位突變提高其半衰期。采用盒式突變使葡萄糖異構酶分子中酸性氨基酸集中區域用堿性氨基酸替代，從而改變酶作用的最適pH環境。第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。將人的干擾素的cDNA在大腸桿菌中進行表達，產生的干擾素的抗病毒活性為106U/mg，只相當于天然產品的十分之一，雖然在大腸桿菌中合成的β-干擾素量很多，但多數是以無活性的二聚體形式存在。為什么會這樣？如何改變這種狀況？研究發現，β-干擾素蛋白質中有3個半胱氨酸（第17位、31位和141位），推測可能是有一個或幾個半胱氨酸形成了不正確的二硫鍵。研究人員將第17位的半胱氨酸，通過基因定點突變改變成絲氨酸，結果使大腸桿菌中生產的β-干擾素的抗病性活性提高到108U/mg，并且比天然β-干擾素的貯存穩定性高很多。第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日第二節理性分子設計和定位突變技術第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日一、理性分子設計的主要步驟：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質的二維重組和三維晶體結構;（4）設計各種處理條件，了解蛋白質的結構變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日二、定位突變定位突變：在已知蛋白質結構與功能的基礎上，在已知DNA序列中取代、插入或刪除特定的核苷酸，從而產生具有新性狀的蛋白質分子的一種蛋白質工程技術。第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日三、定位突變在酶結構改造中的應用（一）淀粉酶B.licheniformmisα-淀粉酶的雙突變體A209V/H133T，酶在90℃的半衰期延長了9倍。Mitchinson等人用定點突變和高通量篩選的方法得到了一個突變體，其最適pH值提高了0.5～1.0。Gloria等人用Phe或Tyr來替B.stearothermophilusα-淀粉酶289位的Ala，其具有了催化醇化反應的能力。Sierks等人報道了通過改變葡萄糖淀粉酶活性位點的三個氨基酸殘基，其作用于1,4-糖苷鍵相對于1,6-糖苷鍵的Kcat/Km比值提高了300倍。第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日（二）蛋白酶枯草桿菌蛋白酶活性位點內有一個Met殘基，利用定位突變技術用Cys代替Met可增加該蛋白酶的活力。用不可氧化氨基酸（Ser、Ala、Len）構造的枯草桿菌蛋白酶能抗氧化，不易失活。第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日（三）纖維素酶Hakamada等人用定點突變的方法將細菌堿性纖維素酶的Glu137、Asn179和Asp194突變為Lys，其熱穩定性得到了提高。Zhang等人專門研究了T.fusca纖維素酶Ce16A表面殘基對底物專一性的影響，發覺突變體R237A對羧甲基纖維素的活力提高了。后來他又研究了靠近活性位點殘基對催化活性、底物專一性、配基連接親和性的影響，4個殘基（His159、Arg237、Lys259、Glu263）的7個突變體對羧甲基纖維素的活性都有所提高，其中K259H突變體的活性提高的最為顯著。第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日在高溫下Asn和Gln容易脫氨形成Asp和Glu，而導致蛋白質分子構象的改變，使蛋白質失去活性。對釀酒酵母的磷酸丙糖異構酶進行誘變改造。這種酶有兩個相同的亞基，每個亞基含有2個Asn，由于它們都位于亞基之間的界面上，可能對酶的熱穩定性起決定性作用。通過寡核苷酸介導的定向誘變技術，將第14位和第78位上的2個Asn分別轉變成Thr(蘇氨酸)和Ile(異亮氨酸)殘基，大幅度提高突變酶的熱穩定性。

轉化氨基酸殘基，改善蛋白質熱穩定性

第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日

改變酶的最適pH值條件

葡萄糖異構酶最適pH為堿性，在80℃穩定，而在堿性條件下，80℃時使高果糖漿焦化產生有害物質，反應只能在60℃進行。采用盒式突變技術將葡萄糖異構酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的區域置換為堿性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖異構酶的最適pH值變為酸性，即可在高溫下進行反應第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日提高酶的催化活性

酶的催化活性由酶分子上的必需基團決定如對酪氨酸-tRNA合成酶進行定點突變在天然狀態下，酪氨酸-tRNA合成酶分子內第51位蘇氨酸殘基的羥基能與底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖環上的氧原子形成氫鍵，這個氫鍵的存在影響酶分子與另一底物ATP的親和力。因此，利用定向誘變技術將酶分子第51位蘇氨酸殘基改變為脯氨酸殘基，酶(Pro-51)與ATP的親和力被增加了近100倍，而且最大反應速度亦大幅度提高。第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日修飾酶的催化特異性

利用定點突變技術葡萄糖淀粉酶的催化特性。如將活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代時，突變體酶分解α-1，4糖苷鍵和α-1，4糖苷鍵的活性比例發生明顯改變修飾Nisin的生物防腐效應

Nisin是乳酸球菌分泌的有較強抗菌作用的小分子肽，可用于罐頭食品、乳制品、肉制品的保藏Nisin由34個氨基酸殘基構成第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日改變Nisin氨基酸的序列，可增強其穩定性、溶解度和擴大抑菌譜等，擴大Nisin的應用范圍。Nisin分子結構中包含5種稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它們通過硫醚鍵形成五個內環。第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日蛋白質在風味修飾蛋白方面的應用1、物理改性2、化學改性（1）堿處理（2）酸處理（3）琥珀酰化作用（4）乙酰化作用（5）磷酸化作用（6）酰胺化作用（7）硫醇化作用（8）酯化作用（9）糖酰化作用（10）去酰胺基作用第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日融合蛋白技術：通過DNA重組技術將兩個基因重組從而構建和表達多功能新型蛋白質的技術。融合蛋白：通過DNA重組技術得到的兩個基因重組后的表達產物。融合蛋白技術及其應用第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日融合蛋白技術的應用雙功能酶：

β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯反應產生NADH的速度是同時加入這兩種酶的反應速度的兩倍以上。同時過渡態時間縮短近四倍。靶向藥物：

定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結合的配基。通過融合蛋白技術將這兩部分融合在一起，即可構成一個具有獨特構象與功能的蛋白質。

例：胸腺素/干擾素融合蛋白用于乙型肝炎等的治療。抗菌肽：例：抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白，可抑制HIV病毒。第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期日食物蛋白改性技術化學改性：針對蛋白質的氨基、羥基及羧基進行化