菌種的傳代與保藏

內蒙自治區藥品檢驗所

菌種是從事微生物學及生命科學探討的基本材料，在醫學領域中，診斷制品的制備，菌苗的生產、微生物致病性探討，藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種.微生物具有生命活力，在傳代過程中易發生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項重要的基礎工作，是微生物學基礎工作的一項重要內容，也是藥品微生物工作中的一項常用技術。一、菌種保藏的意義如藥品中的限制菌檢查運用的陽性比照菌須防止因多次傳代而使陽性比照菌的典型生物學特征發生變更及菌株的死亡，保證達到菌種長期正確的形態；如藥品微生物學檢驗過程中，檢出的可疑致病菌須妥當保藏，以達到進一步鑒定的目的，保證用藥平安。

二、菌種代號的意義

國內藥品微生物檢驗所用的菌種代號是CMCC（F）或CMCC（B）CMCC——中國醫學菌種保藏中心B——代表細菌，F——代表真菌。大腸桿菌[CMCC(B)44102]乙型副傷寒沙門桿菌[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]生孢梭菌[CMCC(B)64941]白色念珠菌[CMCC(F)98001]

三、常用菌種保藏方法

(一)菌種保藏的原理依據微生物的菌種生理、生化特性，在人工創建的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞基本處于休眠狀態，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏養分等環境條件都有抑制微生物的代謝作用。低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。選擇保藏方法時，首先應考慮方法能否長期地保持菌種原有的特性，同時也應兼顧到方法的經濟和簡便。在實際工作中，往往多種條件同時運用,以提高保藏效果。（二）菌種保藏步驟①選擇特征典型的純菌菌落；②確定保藏的合適菌體形態；③選擇最適宜的保藏方法；④定期對保藏菌種進行檢查，視察是否發生變更，若有變更，須變更保藏方法。保藏期滿應剛好進行移種。1.瓊脂斜面低溫保存法

（1）方法：將常常運用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培育基）上，按規定的溫度和時間培育，待充分生長后，把培育好的簇新菌種用牛皮紙保好，為減緩培育基的水分蒸發，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔2~3個月移種一次，接著進行保藏。若用半固體高層培育基穿刺培育，一般可保藏半年~一年。有的甚至更長時間。（2）適用范圍：細菌、酵母菌、霉菌保藏。大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面生孢梭菌白色念珠菌

需氣菌、厭氣菌培育基真菌培育基各類菌種保藏條件剛好間

菌種培養基保存溫度傳種時間細菌一般多用于營養瓊脂或根據菌種規定選用培養基4~6℃芽孢桿菌3~6個月，其它細菌每個月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃一般4~6個月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個月移植一次（每2個月移植一次）（3）特點：優點是——簡便，易于推廣；一般不須要另選擇保藏用培育基；對大多數微生物都適用。缺點是——保藏期太短；傳代次數多，易發生變異及污染。（4）留意事項：保藏的菌種應是生命活力旺盛的簇新培育物，至少應是第三代的培育物。保藏時，破傷風桿菌可用庖肉培育基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培育基。必需定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異樣應剛好處理。每次移植后，應與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培育基特征和純度無誤后再接著保藏。保藏菌種的培育基應無糖，其他菌類含糖小于2%為宜，以免產酸過多，影響菌種存活。銅綠假單胞菌在冰箱中易發生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

2、液體石蠟保存法：

本法是用石蠟將培育物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發，從而延長菌種的保藏期。

（1）方法：將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5%瓊脂半固體高層培育基中，培育好備用。取化學純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內除去液體石蠟中的水分。將上述液體石蠟加入培育好的菌種試管內，液體石蠟液面以高出培育基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏效果較差。

液體石蠟對各類菌種保藏效果

菌種菌株數保存時間（年）存活率（%）細菌霉菌酵母菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3（3）特點：本方法簡便易行，是試驗室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。（4）留意事項：①保藏時，用簇新培育物接種，應檢查純度和特征后，方可進行保藏。②保藏過程中，需常常視察斜面是否干燥，如干燥，需重新移種。③運用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培育物接種到簇新斜面上培養，待長出新培育物后，再移種一次到新斜面上即可運用。④將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免干脆在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染。⑤液體石蠟在菌種管中高出培育基的高度要嚴格限制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面簡潔干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1㎝為宜。

⑥制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培育基中易造成污染。3、半固體瓊脂培育基（0.5%）4、40%甘油保存法：

四、試驗用菌種的培育傳代方法

程序：凍干菌復蘇————接種（斜面）（菌種傳代）（養分肉湯）制備菌懸液比照菌液檢定用標準菌種，由中國藥品生物檢定所供應，為冷凍干燥菌種。菌種的復蘇與保存在專用無菌室或超凈工作臺內進行。1菌種的復蘇

?把凍干菌種管、滅菌1ml滴管、雙碟、鑷子、養分肉湯培育基、養分瓊脂斜面數支，移入接種室或凈化工作臺。?先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取養分肉湯培育基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。

?取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取養分肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內菌液，分別接種至養分瓊脂斜面及一般肉湯內，并將滴管及菌種管投入消毒液內，將已接種的養分肉湯及養分瓊脂斜面置35~37℃培育22~24h。?取出培育物，細致視察菌苔形態、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉種3代即可應用。如發覺菌型不典型，可進行平板分別單菌落。

2菌種的傳代與保存

方法（1）：菌斜面菌斜面（保存）?培育基應簇新制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再運用。標簽上著名菌名及接種日期。至冰箱取出的菌種斜面，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。?點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，來回通過3次。左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環伸人管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。?堵上棉塞，左手將菌種管放下，取養分瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環伸入管內至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上。?取出接種棒，在火焰旁將培育基管棉塞堵上，然后將接種過細菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。?將已接種畢的細菌管置35~37℃培育22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培育箱內培育7日。取出后放人冰箱保存，一般3個月轉種一次。方法2：菌斜面養分肉湯分別平板菌斜面假如菌落形態不典型可純化，按下列方法傳代（分別菌落）：用接種環取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置養分肉湯中(5ml/支,已滅菌),置35~37℃培育18~24小時后，再用接種環取培育好的養分肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分別平板，置35~37℃培育18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于養分瓊脂斜面，置35~37℃培育18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培育基中，其它用做工作菌種。常用分別平板：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板銅綠假單胞菌——

溴化十六烷三甲銨瓊脂培育基金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培育基沙門菌——SS瓊脂平板

3菌懸液的制備

取上述培育好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺，放置室溫后,用接種環取菌苔少許接種置養分肉湯中(5ml/支,已滅菌),將已接種畢的細菌管置35~37℃培育18~24小時，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。

4比照用菌液制備

取上述培育好的養分肉湯菌懸液（濃菌液）1ml，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1ml加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以此類推，稀釋至含活菌數在50~100個。用平板計數。此稀釋菌液用于試驗后加陽性比照，可在1天內運用。菌種菌種

工作菌種培養基菌懸液對照菌液大腸桿菌營養瓊脂斜面營養肉湯0.9%氯化鈉溶液沙門菌營養瓊脂斜面營養肉湯0.9%氯化鈉溶液金黃色葡萄球菌營養瓊脂斜面營養肉湯0.9%氯化鈉溶液銅綠假單胞菌營養瓊脂斜面營養肉湯0.9%氯化鈉溶液生孢梭菌硫乙醇酸鹽培養基硫乙醇酸鹽培養基0.9%氯化鈉溶液白色念珠菌真菌瓊脂斜面真菌培養基0.9%氯化鈉溶液

五、菌種保管

?菌種保管應有專人負責，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種平安。因工作變動時，必需做好交接工作。?菌種應有具體登記本，包括名稱、分別日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并留意記錄運用、轉移及銷毀狀況和緣由。?各種菌種應按規定時間定期移種。一般每移種3次后作一次