人教教學課題血紅蛋白的提取和鑒定第1頁/共24頁每個肽鏈環繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。第2頁/共24頁課題3血紅蛋白的提取和分離專題5DNA和蛋白質技術第3頁/共24頁一、基礎知識:學生活動1:1、分離生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白質的特性在哪些方面存在差異？3、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質蛋白哪方面的差異進行提純？4、為什么不用雞的血紅細胞而用人的血紅細胞作為實驗材料？5、用什么方法分離相對分子質量不同的蛋白質？第4頁/共24頁凝膠色譜法第5頁/共24頁㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、什么是凝膠？2、什么是凝膠色譜法？學生活動2:3、凝膠色譜法的原理是什么？4、請用自己的話總結出凝膠色譜法分離相對分子質量不同蛋白質的具體過程。第6頁/共24頁第7頁/共24頁1、什么是緩沖液？2、緩沖液的作用是什么？學生活動3:3、緩沖液是如何配置的？你所學過的人體血液的緩沖液有哪些？4、本實驗加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？（二）、緩沖溶液第8頁/共24頁1、什么是電泳？2、影響電泳遷移速度的因素有哪些？學生活動4:4、電泳分離各種分子的原理是什么？

（三）、電泳3、如何消除電荷對電泳遷移速度的影響？5、請描述電泳的過程？第9頁/共24頁第10頁/共24頁第11頁/共24頁電泳檢測結果瓊脂糖凝膠電泳第12頁/共24頁二、實驗操作

蛋白質的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質蛋白質除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。第13頁/共24頁（一）樣品處理1、紅細胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放3、分離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。第14頁/共24頁透析過程第15頁/共24頁（二）凝膠色譜操作

（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。第16頁/共24頁（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。第17頁/共24頁④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。2、不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。第18頁/共24頁（3）樣品加入與洗脫①調節緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續收集。（在分離過程中，如果紅色區帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環繞移動。第19頁/共24頁練習鞏固1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質的空間結構B弄清各種蛋白質的功能C弄清各種蛋白質的合成過程D獲得高純度的蛋白質第20頁/共24頁2、用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的是A相對分子質量較小的蛋白質行程大于相對分子質量較大的蛋白質B相對分子質量較小的蛋白質行程小于相對分子質量較大的蛋白質C相對分子質量較小的蛋白質行程等于相對分子質量較大的蛋白質D二者根本無法比較第21頁/共24頁3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調節pHB維持紅細胞的能量供應C防止微生物生長D防止血液凝固第22頁/共24頁5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數和CO2分子數分別是A4、2B