精頂形花凝素光記PNA-FITC）染色劑產(chǎn)說書（文）主用精子頂體形態(tài)花生凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（PNA-FITC染色試劑是一種旨在使用熒光素標(biāo)記的花生凝集素和赫斯特雙重?zé)晒馊旧夹g(shù)，分析生理性反應(yīng)性或病理性退行性頂體缺失的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種動(dòng)物或人體精子細(xì)胞以及凍存精子細(xì)胞，以及受精時(shí)的精子細(xì)胞。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)便，性能穩(wěn)定，熒光清晰。技背在男科學(xué)（Andrology），精子spermatozoa分析提供了精子生成（spermatogenesis子壽命、以及生育能力的基礎(chǔ)信息。其中精子的活力（動(dòng)能力（精潛力（fertilizingpotential膜結(jié)構(gòu)或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整（integrity反（acrosomalreaction功能的評(píng)價(jià)是子分析的重要指標(biāo)，也是決定人工受孕或體外授精（invitrofertilizationIVF）的重參數(shù)。其中頂體反應(yīng)，是指當(dāng)精子接近卵子實(shí)施授精時(shí)，精子頭部前半端的帽狀結(jié)構(gòu)頂體，釋放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。頂體反應(yīng)測(cè)試是一項(xiàng)穩(wěn)定的精子功能參數(shù)，可以用于預(yù)測(cè)受精成功率。因此頂體的結(jié)構(gòu)完整性intact）是評(píng)價(jià)的主標(biāo)志不育癥和避孕藥物研究的對(duì)象用熒光素標(biāo)記花生凝集Isothiocyano-fluoresceinatedpeanutArachishypogaeaagglutinin；PNA-FITC和赫斯特33258（33258）重?zé)晒馊旧夹g(shù)，是精子頂體反應(yīng)分析和授精效率評(píng)價(jià)的最常用的方法。首先使用赫斯特33258色，分析精子活力，基于赫斯特33258具有有限的膜通透性特點(diǎn)，受到活體精子細(xì)胞（包括游動(dòng)性和非游動(dòng)性精子）的排斥，而容易進(jìn)入死亡精子細(xì)胞。其次使用熒光素標(biāo)記的花生凝集素染料，與頂體外膜糖蛋白上的半乳糖殘基（的結(jié)合，顯示完整性（未反應(yīng)性u(píng)頂體，同時(shí)可以應(yīng)用于受精時(shí)的精卵反應(yīng)。雙染的作用，以幫助區(qū)分生理性反應(yīng)性頂體缺失或病理性退行性頂體缺失。通過常用的熒光顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)4，散發(fā)波長(zhǎng)5）便可清晰觀察到綠色頂體狀態(tài)（產(chǎn)內(nèi)保存液（Reagent）

毫升染色液A（B

微升清理液（Reagent）固著液（ReagentD

毫升毫升染色液B（）

毫升產(chǎn)品說明書

1份保方保存在－20℃冰里；染色液A和B（ReagentB和）避免光照，有效保證月用自1

碘化丙啶：用于精子細(xì)胞染色1.5毫離心管：用于樣品操作的容器微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品染色操作的容器血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)載玻片和蓋玻片：用于精子細(xì)胞爬片（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察染色的精子細(xì)胞細(xì)胞流式儀：用于分析染色的精子細(xì)胞實(shí)步一、熒光顯微鏡分析1．移取新鮮獲得的1毫升精液（時(shí)內(nèi)）到1.5毫升離心管2．放進(jìn)培養(yǎng)箱孵育30鐘3．放進(jìn)微型臺(tái)式離機(jī)離心分鐘，速度600g4．小心抽去上清液5．加入xx毫升存液（混勻顆粒群6．在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整到×

7子細(xì)胞毫升7．移取100微升精子細(xì)胞到新的升離心管8．加入xx微升色液A（ReagentB混勻9．室溫下孵育鐘，避免光照10．放進(jìn)微型臺(tái)式心機(jī)離心分鐘，速度為600g11．小心抽去上清12．加入微升清理液（混勻顆粒群13．放進(jìn)微型臺(tái)式心機(jī)離心分鐘，速度為600g14．小心抽去上清15．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步12至14一次16．加入微升保存液（A混勻顆粒群17．即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端18．用蓋玻片或另個(gè)載玻片推片19．置于空氣中涼20．加上微升預(yù)冷的固著液（Reagent覆蓋樣品表面21．室溫下孵育1鐘22．小心抽去固著23．小心加上升染色液B（Reagent覆蓋樣品表面24．室溫下孵育20分鐘，避免光照25．小心抽去染色26．小心加上升清理液（Reagent覆蓋樣品表面27．小心抽去清理28．蓋上蓋玻片或片液29．即刻在（共聚）熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)（注意：每個(gè)視野計(jì)200個(gè)）觀察藍(lán)色熒光—染色液A（Reagent濾波器激發(fā)波長(zhǎng)350nm，散發(fā)波長(zhǎng)――可見藍(lán)色熒光，2

表明死亡精子細(xì)胞觀察綠色熒光—染色液B（ReagentE濾波器激發(fā)波長(zhǎng)，散發(fā)波長(zhǎng)――可見綠色熒光，表明精子頂體區(qū)域30．分析結(jié)果二、胞流式儀分析1．移取新鮮獲得的1毫升精液（時(shí)內(nèi)）到1.5毫升離心管2．放進(jìn)培養(yǎng)箱孵育30鐘3．放進(jìn)微型臺(tái)式離機(jī)離心分鐘，速度600g4．小心抽去上清液5．加入xx毫升存液（混勻顆粒群6．在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整到×7精子細(xì)/毫升7．移取100微升精子細(xì)胞到新的升離心管8．（選擇步驟）加xx微升染色液A（ReagentB混勻9．（選擇步驟）室下孵育分鐘，避免光照10．（選擇步驟）進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心分鐘，速度600g11．（選擇步驟）心抽去上清液12．（選擇步驟）入xx微升清理液（ReagentC混勻顆粒群13．（選擇步驟）進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心分鐘，速度600g14．（選擇步驟）心抽去上清液15．加入微升染色液B（B混勻顆粒群16．室溫下孵育20分鐘，避免光照17．放進(jìn)微型臺(tái)式心機(jī)離心分鐘，速度為600g18．小心抽去上清19．加入毫升清理液（A混勻顆粒群20．放進(jìn)微型臺(tái)式心機(jī)離心分鐘，速度為600g21．小心抽去上清22．加入微升用戶自備的碘化丙啶（propidiumiodide；0.4克/毫升勻顆粒群23．室溫下孵育5鐘，避免光照24．放進(jìn)微型臺(tái)式心機(jī)離心分鐘，速度為600g25．小心抽去上清26．加入毫升清理液（A混勻顆粒群27．放進(jìn)微型臺(tái)式心機(jī)離心分鐘，速度為600g28．小心抽去上清29．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步26至28一次30．加入毫升清理液（A混勻顆粒群31．即刻進(jìn)行細(xì)胞式儀分析：觀察個(gè)細(xì)胞以上，200胞秒激發(fā)波長(zhǎng)

488nm488nm350nm染料

染色液（ReagentE）

用戶自備化丙啶

染色液（ReagentB）（iodide）3

匹配熒光料

異硫氰酸熒光素（FITC）藻紅蛋白（phycoerythrin熒光顏色散發(fā)波長(zhǎng)流式儀通熒光增強(qiáng)

綠色530nmFL2精子頂體完整性

紅色630nmFL3精子膜完整性

藍(lán)色460nmFL1死亡精子細(xì)胞32．三色標(biāo)記細(xì)胞式儀檢測(cè)參考圖像如下（X軸FL2綠色熒光；軸：FL3紅色熒光）象限左下象限左上象限右下象限右上象限

熒光結(jié)果—PNAHOUCHSTPI+PNA—HOUCHST+—PNA+HOUCHST

結(jié)果分析完整頂體和膜的活體精子細(xì)胞完整頂體而不完整膜的死亡精子細(xì)胞頂體損壞而膜完整的活體精子細(xì)胞頂體損壞和不完整膜的死亡精子細(xì)胞注事1．本產(chǎn)品為次操作2．操作時(shí)須戴手套3．樣品檢測(cè)前，建在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)4．精子細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)上稀釋倍數(shù)

。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（）的計(jì)算方法是：1米方塊的細(xì)胞計(jì)數(shù)X（稀釋倍數(shù)）＝實(shí)際細(xì)胞數(shù)/毫升5．染色完成后，即進(jìn)行檢測(cè)分析6．用戶可以使用鈣子載體A23187或Ionomyci