關于克隆基因的檢測與鑒定第1頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三第六講克隆基因的檢測與鑒定載體表型選擇法根據插入基因的表型選擇DNA電泳檢測法核酸雜交檢測法免疫化學檢測法轉譯篩選法第2頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三一、抗藥性標記及其插入失活選擇法pBR322質粒上有兩個抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位點BamHI和SalI;Ampr上有插入位點PstI。第一節載體表型選擇法1.原理：第3頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三pBR322第4頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三（1）四環素：（2）氨芐青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素標記選擇產生-內酰胺酶，使氨芐青霉素轉變為青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍灰色）褪色。抑制細菌生長，但不殺死細菌。殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。（3）環絲氨酸：第5頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三3.選擇過程：如果在Tetr上插入外源DNA，導致四環素抗性基因失活，可用四環素加環絲氨酸平板培養基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環素抑制，不被環絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的菌抗四環素，能分裂生長，反而被環絲氨酸殺死。（1）四環素抗性插入失活第6頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三無環絲氨酸培養基第7頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。第8頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三二、-半乳糖苷酶顯色反應選擇法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍++深藍色1.原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）?？梢员籌PTG誘導表達。載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的-半乳糖苷酶。第9頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三假陽性：如果插入的外源DNA正好是3的倍數并且沒有中止密碼；（不破壞肽）。2.選擇過程第10頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三-半乳糖苷酶使X-gal分解成藍色產物。第11頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三利用插入的外源基因的表達產物特性進行直接選擇。（只在特定條件下）。轉化進來的外源基因產物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。一、原理：第二節根據插入基因的表型選擇1.彌補缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養基中生長第12頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三小鼠的二輕葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體連接轉化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養基平板含DHFR的克隆才能生長例：使被轉化的受體菌表現出外源基因的表型。2.增加新性狀第13頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測法從轉化后的菌體克隆中分離質粒，電泳、比較其分子量。第三節DNA電泳檢測法分子量Marker載體重組克隆第14頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三二、酶切電泳篩選法1.原理：根據已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內切酶切割質粒，電泳后比較電泳結果（DNA帶數和長度）?；蛴煤线m的內切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結果是否符合預計的結果。第15頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三ABA或B第16頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三第17頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三不同克隆的酶切結果第18頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三篩選過程第19頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三三、PCR擴增檢測法1.原理PCR能在模板序列上擴增出預期DNA片斷。2.過程（1）從重組克隆中提取質粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR。（3）電泳PCR產物。（4）檢查是否有PCR產物。（5）PCR產物的長度是否與外源基因一致。第20頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三1.核酸雜交第四節核酸雜交檢測法

一、原理：重組克隆與探針雜交。3.識別標記32P或125I。（1）放射性同位素2.檢測用的探針與外源DNA插入片斷互補的序列。（2）非放射性標記熒光素第21頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三二、核酸雜交檢測方法用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。1.Southernblotting從宿主細胞中提取DNA（或質粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。第22頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三酶切前酶切后插入片斷載體第23頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三Southernblot篩選結果第24頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三（1）原位雜交篩選特點：對應的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。第25頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三第26頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三（2）R-環檢測法DNA-RNA雜交。1）原理：2）選擇過程在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩定。電鏡下可見一種R-環形結構。用外源基因的mRNA與重組載體雜交。第27頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三缺點：需要電鏡！第28頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三2.Northernblotting用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。主要檢測插入片斷是否被轉錄。從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交。第29頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三利用抗體作為“探針”來檢測轉入受體菌并且表達出相應的蛋白質的外源基因。根據第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質可分為幾種作用方式：一、放射性抗體檢測法第五節免疫化學檢測法1.抗體與產物的結合方式對表達產物的檢測。蛋白——蛋白“雜交”第30頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三待測基因產物蛋白一抗二抗125I標記的二抗結合蛋白固相支持濾膜待測基因產物蛋白一抗125I標記的二抗固相支持濾膜待測基因產物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因產物蛋白一抗二抗125I標記的二抗結合蛋白125I標記的二抗第31頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三2.放射性抗體檢測法過程第32頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三3.Broome-Gilbert雙位點檢測法質?；駻插入基因B表達質粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白檢測融合蛋白。既檢測外源基因產物又檢測載體基因產物。第33頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三固相支持濾膜抗A抗體125I標記的抗B抗體質粒蛋白A外源蛋白B質粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發光，底片曝光第34頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三二、免疫沉淀檢測法把非放射性抗體加到平板培養基中，當插入基因的表達產物被細菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應形成“沉淀圈”。1.原理抗原——抗體凝集反應。檢測分泌型產物。2.方法第35頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三對于不能被分泌到菌體外的蛋白質可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發）。第36頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三三、酶聯免疫吸附測定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理：一抗（primaryantibody）:

與目標分子的特異結合。二抗（secondaryantibody）：與一抗的特異性結合。酶連（enzyme-linke）：二抗上攜帶一種酶能催化一種反應將無色的底物轉變為有色的物質（或發光），再通過比色測定有色物質的含量（或光強度），從而推測目標分子的含量。第37頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三待測基因產物蛋白一抗二抗酶

待測基因產物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產物比色觀察酶

第38頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三2.ELISA檢測的一般步驟（1）固定樣品將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎椎?9頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三加入一抗，反應后沖洗掉未結合的抗體。（2）一抗結合一抗第40頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三加入二抗，與一抗結合后再將未結合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上聯著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗結合二抗第41頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應轉變成有色物質（或發光）。（4）顯色反應第42頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三第43頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三在特殊的分光光度儀（酶標儀）上比色，打印出結果。（5）比色第44頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三3.ELISA的局限性有效，但準確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）第45頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三臨床檢驗常用的單抗第46頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三四、免疫印跡（westernblotting）法1.原理：在蛋白質凝膠電泳以后，用轉膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質泳帶。（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是蛋白質的變性劑，使煮沸變性的蛋白質維持線性狀態，并與蛋白質結合，使蛋白質帶上負電荷。①SDS:（SDS）：第47頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三②聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場的作用下線性蛋白質鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer第48頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三點樣電泳方向第49頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三③蛋白質電泳的分子量標準已知分子量的蛋白質混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質提供分子量估計。商品化供應Da道爾頓(質量單位,等于一氧原子質量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓第50頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三DaltonSDSPAGE第51頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三④凝膠中的蛋白質染色：考馬斯亮藍：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉到膜上進行染色。1）直接染色第52頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三直接染色電泳結果第53頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三（2）Westernblotting電泳膠里的蛋白質帶可以用電轉的方法，轉到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。①Western（轉膜）膠里的蛋白質帶在電場的作用下橫向轉移到正極一側的膜上。膜膠蛋白第54頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三Western裝置第55頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三②Blotting原理與ELISA相同。待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產物，并發出光PAGE膠待測蛋白底片曝光辣根過氧化物酶：HRPO第56頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三第57頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與膜上的蛋白結合。2）洗去未結合的一抗。3）用二抗與一抗結合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。③Blotting過程ImmunoBlotting第58頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三④結果多克隆抗體Blotting的結果單抗blotting結果第59頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三一、無細胞翻譯系統第六節轉譯篩選法能把外源的mRNA翻譯成蛋白質的細胞提取物。如：麥胚提取物系統、網織紅細胞提取物系統。借助無細胞翻譯系統，通過表達或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉錄，來篩選其產物是否符合預期。適用于mRNA轉錄豐度高的外源基因。第60頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三二、轉譯篩選mRNA無細胞翻譯系統35S標記的甲硫氨酸翻譯35S標記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性帶紋的位置載體+外源DNA轉錄與預期的產物分子量相符？第61頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三三、雜交抑制轉譯法mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質（轉譯被抑制）。單鏈mRNA核糖體小亞基核糖體大亞基能翻譯mRNADNA核糖體小亞基核糖體大亞基不能翻譯1.原理第62頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三2.過程第63頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三四、雜交釋放轉譯法1.原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應的mRNA，進行體外轉錄。研究其轉錄產物的性質是否是預期的基因產物（如分子量、免疫原性等）。第64頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三2.過程硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA總mRNAcDNA基因的mRNA雜交洗脫cDNA基因的mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編碼的蛋白硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA收集35S標記的氨基酸第65頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三專門設計檢測能同DNA特異結合的蛋白質因子。待測蛋白質硝酸纖維素濾膜能與蛋白質結合的DNA序列放射性標記待測蛋白質硝酸纖維素濾膜能與蛋白質結合的DNA序列放射性標記五、DNA-蛋白質相互作用篩選法第66頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三一般克隆與篩選策略第67頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三第七節幾種常用的真核生物重組基因選擇方法真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）一、哺乳動物基因轉移的選擇標記1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK選擇原理①四氫葉酸的必要性DHFR第68頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP

dATPTTPdCTP氨甲喋啉

抑制抑制第69頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三④胸苷酸激酶的補救作用TK+細胞能產生胸苷酸激酶，所以可以利用培養基中的胸苷（T）合成TTP，存活。Ttk③次黃嘌呤的補救作用細胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP

dATPTTPdCTP次黃嘌呤補救氨甲喋啉

抑制抑制第70頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三①HAT培養基：Tk-

細胞株。TK基因。②宿主細胞③載體標記（2）TK選擇過程含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有轉入TK基因的細胞才能生存。第71頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三第72頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。2.二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（1）選擇原理①二氫葉酸還原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸第73頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三DHFR+細胞二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+細胞能產生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養基中生存不需要補救！第74頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三DHFR-

細胞DHFR-

細胞不能產生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養基中生存。需要補救！第75頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三②胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤補救胸苷補救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救:第76頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三DHFR-細胞株（不能在無核苷酸的培養基中生長）。①宿主細胞（2）選擇過程透析除去血清中的內源性核苷酸，以免補救。②無核苷酸的培養基需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救！第77頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三③氨甲喋呤“加壓”添加少量氨甲喋啉抑制內源性DHFR的補救作用，可提高選擇。DHFR+基因。④載體標記只有轉入DHFR+基因的細胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie無核苷酸的培養基第78頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三是細菌抗生素，干擾細菌的核糖體，使細菌的蛋白質合成不能正常進行，但不影響真核生物。3.新霉素抗性基因（neor）（1）選擇原理①新霉素（neomycin）新霉素的類似物，是一種氨基糖苷，對真核細胞和原核細胞都有毒性。②G418（geneticin）第79頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三③新霉素抗性基因--neor細菌的新霉素抗性基因（neor）編碼一種磷酸轉移酶（APH），能使G418失活。G418真核細胞死亡G418存活neor真核細胞第80頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三含致死劑量G418的完全培養基。①G418培養基真核細胞株均可。neor基因。②宿主細胞③載體標記（2）選擇過程G418：（100-800g/mL）第81頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三CAT是由大腸桿菌轉座子Tn9編碼的，催化氯霉素發生乙?；Щ?。氯霉素cat含氯霉素的完全培養基。真核細胞株均可。cat基因。乙酰氯霉素4.氯霉素乙酰轉移酶（CAT）（1）選擇原理（2）選擇條件（3）宿主細胞（4）載體標記chloramphenicolacetyltransferase第82頁，共91頁，2023年，2月20日，星期三在轉化的細胞提取物中測定是否有乙酰氯霉素。（5）CAT分析方法②免疫學檢查：用抗CAT的血清進行Westernblot或ELISA，檢查CAT的表達。Anti-CATAntiserumisavailablefromInvitrogen.OtherkitstoassayforCATproteinusingELISAassayareavailablefromRocheM