RNA的生物合成中藥第1頁(yè)/共61頁(yè)第14章RNA的生物合成RNABiosynthesis(Transcription)第2頁(yè)/共61頁(yè)轉(zhuǎn)錄(transcription)是生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄RNADNA

第3頁(yè)/共61頁(yè)參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)：原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:

DNA酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白質(zhì)因子第4頁(yè)/共61頁(yè)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別第5頁(yè)/共61頁(yè)轉(zhuǎn)錄的基本特征第一節(jié)第6頁(yè)/共61頁(yè)一、選擇性轉(zhuǎn)錄DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)。第7頁(yè)/共61頁(yè)對(duì)結(jié)構(gòu)基因的具體轉(zhuǎn)錄方式是不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)，它有兩方面含義：在DNA分子雙鏈上，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；其二是模板鏈并非總是在同一單鏈上。二、不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄第8頁(yè)/共61頁(yè)5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N(xiāo)······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作反義鏈。相對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈(codingstrand)，也稱為有義鏈。第9頁(yè)/共61頁(yè)5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄三、轉(zhuǎn)錄后加工第10頁(yè)/共61頁(yè)RNA聚合酶第二節(jié)第11頁(yè)/共61頁(yè)一、RNA聚合酶的特點(diǎn)DNA依賴的RNA聚合酶催化合成RNA；RNA合成的化學(xué)機(jī)制與DNA依賴的DNA聚合酶催化DNA合成相似。合成方向5’-3’。(NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPiRNA延長(zhǎng)的RNA第12頁(yè)/共61頁(yè)DNA聚合酶在啟動(dòng)DNA鏈延長(zhǎng)時(shí)需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動(dòng)RNA鏈的延長(zhǎng)。RNA聚合酶和DNA的特殊序列——啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合后，就能啟動(dòng)RNA合成。第13頁(yè)/共61頁(yè)二、原核生物RNA聚合酶還有ω亞基,分子量10100,促RNA聚合酶裝配第14頁(yè)/共61頁(yè)RogerKornbergwinsthe2006NobelPrizeinChemistry

HeandhisfatherarethesixthfatherandsontowinNobelPrizes第15頁(yè)/共61頁(yè)核心酶

(coreenzyme)全酶

(holoenzyme)轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)階段ωω第16頁(yè)/共61頁(yè)三、真核生物RNA聚合酶真核生物具有3種不同的RNA聚合酶:RNA聚合酶Ⅰ（RNAPolⅠ）RNA聚合酶Ⅱ（RNAPolⅡ）RNA聚合酶Ⅲ（RNAPolⅢ）第17頁(yè)/共61頁(yè)真核生物的RNA聚合酶RNA聚合酶Ⅱ由12個(gè)亞基組成第18頁(yè)/共61頁(yè)間隔序列間隔序列28S5.8S18S45SrRNA間隔序列間隔序列28S5.8S18SDNA第19頁(yè)/共61頁(yè)destroyingangel第20頁(yè)/共61頁(yè)第21頁(yè)/共61頁(yè)RNA聚合酶Ⅱ最大亞基的羧基末端有一段共有序列(consensussequence)為T(mén)yr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重復(fù)序列片段，稱為羧基末端結(jié)構(gòu)域(carboxyl-terminaldomain,CTD)。CTD對(duì)于維持真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄是必需的。第22頁(yè)/共61頁(yè)大腸桿菌RNA的轉(zhuǎn)錄合成第三節(jié)第23頁(yè)/共61頁(yè)一、轉(zhuǎn)錄起始每一個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，在原核生物中被稱為操縱子(operon)。操縱子包括若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。5335結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol第24頁(yè)/共61頁(yè)1、啟動(dòng)子調(diào)控序列中的啟動(dòng)子是RNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位，也是控制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。原核生物以RNA聚合酶全酶結(jié)合到DNA的啟動(dòng)子上而起動(dòng)轉(zhuǎn)錄，其中由σ亞基辨認(rèn)啟動(dòng)子，其他亞基相互配合。第25頁(yè)/共61頁(yè)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)RNA-pol結(jié)合位點(diǎn)(Pribnow框)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(Sextama框)55

啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)基因33第26頁(yè)/共61頁(yè)第27頁(yè)/共61頁(yè)RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開(kāi)，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。2、起始過(guò)程轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問(wèn)題：第28頁(yè)/共61頁(yè)E.coli的轉(zhuǎn)錄起始和延長(zhǎng)第29頁(yè)/共61頁(yè)2.DNA雙鏈局部解開(kāi)，形成開(kāi)放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(opentranscriptioncomplex)

；1.RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(closedtranscriptioncomplex)

；3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:5-pppG-OH+

NTP5-pppGpN

-OH3+ppi轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程：第30頁(yè)/共61頁(yè)第一個(gè)磷酸二酯鍵生成后，σ亞基即從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上脫落，核心酶連同四磷酸二核苷酸，繼續(xù)結(jié)合于DNA模板上，酶沿DNA鏈前移，進(jìn)入延長(zhǎng)階段。第31頁(yè)/共61頁(yè)二、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi第32頁(yè)/共61頁(yè)轉(zhuǎn)錄空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）

····DNA

····RNA第33頁(yè)/共61頁(yè)53DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)在進(jìn)行；轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進(jìn)行。這種形狀說(shuō)明：第34頁(yè)/共61頁(yè)原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯同步進(jìn)行的現(xiàn)象第35頁(yè)/共61頁(yè)Electronmicrographdemonstratingthattranslationoccursconcomitantlywithtranscription

第36頁(yè)/共61頁(yè)依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止不依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止三、轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來(lái)不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來(lái)。依據(jù)是否需要蛋白質(zhì)因子的參與，原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為：第37頁(yè)/共61頁(yè)ρ因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。ρ因子能結(jié)合RNA，又以對(duì)polyC的結(jié)合力最強(qiáng)。ρ因子還有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。1、依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止ρ因子：第38頁(yè)/共61頁(yè)ρ因子的作用原理：序列中有富含CA的rut元件第39頁(yè)/共61頁(yè)目前認(rèn)為，ρ因子終止轉(zhuǎn)錄的作用是：與RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，結(jié)合后ρ因子和RNA聚合酶都可發(fā)生構(gòu)象變化，從而使RNA聚合酶停頓，解螺旋酶的活性使DNA/RNA雜化雙鏈拆離，利于產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放。第40頁(yè)/共61頁(yè)2、不依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列(使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物富含G/C的回文序列和一連串的U序列)，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來(lái)終止轉(zhuǎn)錄。第41頁(yè)/共61頁(yè)5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3DNAUUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`近終止區(qū)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)是非依賴ρ因子終止的普遍現(xiàn)象。第42頁(yè)/共61頁(yè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理：

使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG5335RNA-pol第43頁(yè)/共61頁(yè)真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄后加工第四節(jié)第44頁(yè)/共61頁(yè)真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA分子是初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物(primaryRNAtranscript，hnRNA)經(jīng)過(guò)加工而來(lái)。加工主要在細(xì)胞核中進(jìn)行。一、mRNA前體第45頁(yè)/共61頁(yè)第46頁(yè)/共61頁(yè)真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開(kāi)但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。斷裂基因(splitegene)CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)第47頁(yè)/共61頁(yè)外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)外顯子：在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過(guò)程中被除去的核酸序列。第48頁(yè)/共61頁(yè)幾種主要的修飾方式：1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修飾(modification)4.

添加(addition)第49頁(yè)/共61頁(yè)1、加帽大多數(shù)真核mRNA的5’-末端有7-甲基鳥(niǎo)嘌呤的帽結(jié)構(gòu)。這個(gè)真核mRNA加工過(guò)程的起始步驟由兩種酶，加帽酶(cappingenzyme)和甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)催化完成。

第50頁(yè)/共61頁(yè)帽子結(jié)構(gòu)：第51頁(yè)/共61頁(yè)帽子結(jié)構(gòu)的意義：可以使mRNA免遭核酸酶的攻擊；也能與帽結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合體(cap-bindingcomplexofprotein)結(jié)合，并參與mRNA和核糖體的結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的生物合成。第52頁(yè)/共61頁(yè)尾部修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同時(shí)進(jìn)行的過(guò)程。polyA的有無(wú)與長(zhǎng)短，是維持mRNA作為翻譯模