其次章工業發酵菌種選育第一節工業發酵生產菌種工業常用的生產菌種微生物的代謝產物發酵對生產菌種的要求工業發酵菌種的來源現代發酵技術一工業常用的生產菌種細菌放線菌酵母菌霉菌由于發酵工程本身的發展以及遺傳工程的介入，

藻類、病毒等也正在逐步地變為工業生產用的生物。現代發酵技術1、細菌

枯草芽孢桿菌乳酸桿菌醋酸桿菌棒狀桿菌短桿菌淀粉酶蛋白酶乳酸氨基酸肌苷酸

用于生產：現代發酵技術1、細菌

現代發酵技術1、細菌

現代發酵技術2、放線菌常用的放線菌：

鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。它的最大經濟價值在于能產生多種抗生素。

如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。現代發酵技術3、酵母菌釀酒面包低凝固點石油脂肪酶酵母菌體蛋白生產應用

工業上用的酵母菌啤酒酵母假絲酵母類酵母現代發酵技術藻狀菌綱根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱紅曲霉半知菌類曲霉、青霉4、霉菌產品酶制劑抗生素有機酸甾體激素等現代發酵技術5、其他生物：A:擔子菌B：藻類藻類工廠現代發酵技術二微生物的代謝產物初級代謝產物次級代謝產物轉化產物現代發酵技術初級代謝和次級代謝關系產生初級代謝產物，后產生次級代謝產物初級代謝是次級代謝的基礎次級代謝是初級代謝在特定前提下的接著與發展現代發酵技術1、初級代謝產物是指微生物通過代謝活動所產生的、

自身生長和繁殖所必需的物質，

如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。初級代謝作用

能使養分物轉化為結構物質與具生理活性物質

為生長供應能量。嚴格受代謝調控限制。現代發酵技術2、次級代謝產物通過次級代謝合成的產物

依據其作用,可將其分為抗生素,激素,生物堿,毒素等類型.以初級代謝產物為原料進行合成。合成受環境影響大，對自身無明確生理作用。現代發酵技術3、轉化產物外源物質加入培育基后，在微生物代謝過程結構發生了化學變更所得的產物。降解木質素類真菌和能降解多環芳香烴類的球紅假單胞菌作為煤炭轉化用的微生物，現代發酵技術三發酵對生產菌種的要求

微生物的特性工業化菌種的要求志向的生產菌種利用微生物的特點：

(1)對四周環境有極大的適應實力(2)有極強的消化實力(3)有極強的繁殖實力現代發酵技術

有些微生物能在厭氧的條件下生長有些微生物能夠利用簡潔的有機物和無機物滿足自身的生長有些微生物能進行困難的代謝有些微生物能利用較困難的化合物

有些微生物能在極端的環境下生長1、微生物的特性現代發酵技術

能夠利用廉價的原料，大量高效地合成產物有關合成產物的途徑盡可能地簡潔

遺傳性能相對穩定

不易感染它種微生物或噬菌體

產生菌及其產物的毒性低

生產特性要符合工藝要求2、工業化菌種的要求現代發酵技術生長繁殖快速；產量高；易培育；發酵周期短；耐噬菌體；純種。3、志向的生產菌種現代發酵技術四工業發酵菌種的來源

從自然界中分別對野生菌株進行人工誘變運用重組DNA技術改造菌種保藏機構獲得從正突變的生產菌中獲得現代發酵技術其次節生產菌種的選育目前育種總趨勢菌種選育的主要目的菌種選育的重要指標常用的菌種選育方法現代發酵技術一、目前育種總趨勢

從野生菌轉向變異菌自然選育轉向代謝育種從誘發基因突變轉向基因重組的定向育種。現代發酵技術二、菌種選育的主要目的提高產量改進質量增加新品種改善工藝條件現代發酵技術原始產生菌實例青霉素產生菌產黃色色素土霉素產生菌產大量泡沫紅霉素產生菌不耐噬菌體不再分泌黃色色素泡沫削減耐噬菌體工業生產菌現代發酵技術三、菌種選育的重要指標：菌種的養分特征菌種的生長溫度菌種的適應性菌種的穩定性產物的得率和產物的濃度產物回收難易現代發酵技術四、常用的菌種選育方法自然選育誘變育種雜交育種基因工程育種現代發酵技術常用的名詞自發突變和誘發突變突變率正向變異（有益于生產的變異）負向變異（不利于生產的變異）衰退（菌種發生了負向變異）復壯（使衰退的菌種復原原有的優良性能）現代發酵技術

1、自然選育定義目的特點操作步驟現代發酵技術

1）定義指利用微生物在確定條件下產生自發突變，通過分別、篩選解除衰變型菌落，從中選擇正向變異菌株的過程。例如：從污染噬菌體的發酵液中

有可能分別到抗噬菌體的新菌株。現代發酵技術從自然界篩選現代發酵技術顯著減毒的結核桿菌

（卡介苗）Descriptionofthecompany’sproducts定向培育230代13年自然育種的成功實例

1923年獲得卡介苗(BCGvaccine)牛型結核桿菌現代發酵技術2）目的純化復壯穩定生產現代發酵技術3）特點自發突變率低，變異程度較略微，變異過程特殊緩慢（突變率10－9～10－6）自發突變不定向，負向變異可能性大，正向變異可能性小現代發酵技術4）操作步驟確定采樣環境

采樣

設計實驗方案充分查閱資料增殖培養

確定增殖條件純種分離劃線、稀釋與組織分離

菌種篩選

純種鑒定、生產能力考查毒性試驗其他鑒定現代發酵技術采樣采樣對象采樣季節采樣方式現代發酵技術采樣對象—土壤細菌和放線菌一般園田土和耕作過的沼澤土酵母和霉菌

富含碳水化合物的土壤和沼澤地中,如一些野果生長區和果園內采樣的對象也可以是植物、腐敗物品、某些水域等。現代發酵技術采樣季節以溫度適中，雨量不多的初秋為好采樣方式選點—在選好適當地點，用小鏟子除去表土取土—取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中扎好。標記—記錄采樣時間、地點、環境條件等，分別—將樣品逐步分批寄回，剛好分別。現代發酵技術增殖培育通過選擇培育基來限制例如碳源利用的限制可選定糖、淀粉、纖維素或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。現代發酵技術純種分別通過增殖培育，微生物還處于混雜生長狀態進一步應用選擇性限制條件分別純種分別的方法有稀釋分別法、劃線分別法等現代發酵技術稀釋分別法現代發酵技術平皿劃線分別法b.連續劃線分別法a.分區劃線分別法現代發酵技術從產物角度動身依據產物的性質有目的地設計培育基來篩選菌種從形態角度動身依據菌落的外觀形態反映的微生物重要表征篩選。如多糖產生菌在適當的培育基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。菌種篩選（初篩+復篩）（1）平板篩選（初篩）現代發酵技術從生產性能考察小型發酵試驗（搖瓶試驗）考察發酵菌的生產性能，摸索最優的發酵菌種。菌種篩選（2）搖瓶篩選

（初篩+復篩）現代發酵技術篩選原理變色圈法透亮圈法生長圈法抑菌圈法菌種篩選現代發酵技術瓊脂培育基測試菌苔含藥物濾紙

抑菌圈抑菌圈法現代發酵技術自然界自然微生物可能產生毒素據規定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為與食品工業有關的菌種，均需通過兩年以上的毒性試驗。其他鑒定—毒性試驗現代發酵技術2、誘變育種AddyourtitleinhereAddyourtitleinhere誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變進行的篩選。包含誘變與篩選兩個部分。誘變以誘變劑處理樣品，造成大量死亡時使存活個體的突變率大幅提高。篩選淘汰負突變株，選出正突變株。現代發酵技術青霉素生產菌株的誘變育種1943年，產黃青霉每毫升發酵液只產生約20單位的青霉素，通過透變育種和其它措施協作，目前的發酵單位已達到每毫升5萬～10萬單位。現代發酵技術（1）誘變育種的步驟TextinhereTextinhereTextinhereTextinhere出發菌株的選擇（制定篩選目標）突變的誘發（誘變劑的選擇）突變株的篩選現代發酵技術動身菌株—指用于誘變的原始菌種來源從自然界分離生產菌種菌種保藏機構動身菌株的選擇性狀要求純種對誘變劑敏感生長快營養要求粗放發育早，產孢子多能積累少量產品或前體物篩選目標高產副產品及有害產物少改良工藝現代發酵技術處理菌懸液的制備關鍵—制備單細胞和單孢子狀態、活力類似的菌懸液誘變霉菌或放線菌時，應處理孢子；對芽孢桿菌則應處理芽孢要得到勻整分散的細胞懸液，可用無菌的玻璃珠來打散成團的細胞，然后再用脫脂棉過濾菌懸液溶度：真菌、酵母（106—107個/ml）；

細菌（108個/ml），一般用生理鹽水或0.1M的磷酸緩沖液稀釋。動身菌株的選擇現代發酵技術誘變處理方法誘變劑—能夠提高生物體突變頻率的物質誘變劑的種類突變的誘發（誘變劑的選擇）誘變劑的選擇劑量現代發酵技術噬菌體物理誘變劑化學誘變劑生物誘變劑紫外線、X-射線，γ－射線堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑A誘變劑的種類現代發酵技術誘變劑協同效應菌種單獨處理復合處理誘變劑突變率(%)誘變劑突變率(%)土曲霉紫外線X射線21.319.7紫外線+X射線42.8土曲霉氮芥(0.1%)紫外線不明顯4.7紫外線+氮芥11.0鏈霉菌紫外線γ射線31.035.0紫外線+γ射線43.6現代發酵技術大規模的篩選：用死亡率90～99.9％的高劑量；小規模的篩選：常用死亡率70～90％的低劑量；偶用死亡率40～60％的更低劑量。B誘變劑的劑量誘變劑劑量相關因素物理：射線強度和處理時間化學：誘變劑溶度和處理時間一般選擇死亡率為70%-80%的劑量。現代發酵技術C常用的誘變處理方法制備菌懸液→紫外照射→后培育與稀釋涂布混合藥品與菌液→保溫10~20min后終止反應→后培育與稀釋涂布物理法——紫外誘變化學法——亞硝酸誘變現代發酵技術隨機篩選搖瓶篩選平板篩選理性化篩選依據微生物的代謝產物篩選突變株的篩選現代發酵技術理性化篩選舉例養分缺陷型—因突變而丟失合成某種物質的實力，因此必需在培育基中添加某種物質

才能生長的突變類型。若某抗生素產生菌的初級代謝與次級代謝處于同一分支合成途徑，則篩選初級代謝產物的養分缺陷型常可使相應的次級代謝產物增產。現代發酵技術（課本12頁圖2-1）芳香族氨基酸與氯霉素有共同的中間代謝產物：莽草酸；養分缺陷型細菌合成不了芳香族氨基酸，則莽草酸就會生成大量氯霉素。例一現代發酵技術例二賴氨酸發酵

（高絲氨酸缺陷型谷氨酸棒桿菌）

現代發酵技術雜交育種將兩個基因型不同的菌株經吻合（或接合）使遺傳物質重新組合，再從中分別和篩選出具有新性狀的菌株。為定向育種主要包括雜交和原生質體融合兩種方法。現代發酵技術雜交兩個性狀不同的菌株或變種之間進行細胞結合，遺傳物質交換重新組合成新的性狀。驗證實驗細菌雜交于1946年在大腸桿菌K-12菌株中發覺并證明的養分缺陷型（A—）+養分缺陷型(B—)混合試驗現代發酵技術原生質體融合通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發生融合，并產生重組子的過程，又稱細胞融合。

現代發酵技術基因工程育種把兩個不同性狀個體的遺傳基因轉移到一起,經過遺傳物質分子重新組合,轉入一個受體細胞，形成新遺傳型個體的方式。在分子水平上的雜交

一般的雜交,在細胞水平進行優點：

目的性；方向性；高效率。現代發酵技術菌種保藏的目的與原理菌種保藏的方法菌種保藏的注意事項菌種保藏的機構第三節生產菌種的保藏現代發酵技術一、菌種保藏的目的與原理目的保持菌種存活率減少菌種變異，保持優良性狀不染雜菌。原理根據菌種特性，創造有利于其休眠的環境（如干燥、低溫、缺氧、缺乏營養、加保護劑等）保存孢子、芽孢等的休眠體。現代發酵技術二菌種保藏的方法斜面低溫保藏法液體石蠟封存保藏法砂土管保藏法懸液保藏法真空冷凍干燥保藏法低溫保藏法液氮超低溫保藏法現代發酵技術1、斜面低溫保藏法原理：低溫抑制；方法：把斜面菌種等放入4℃冰箱保藏；保藏時間：一般不超過3個月缺點：傳代次數多，易變異，易污染；改進：接受密封性能較好的螺旋口試管替代傳統的棉塞；削減碳水化合物含量現代發酵技術2、液體石蠟封存保藏法

原理：隔絕空氣；方法：在培育好的菌種斜面上加入無菌石蠟油,高出斜面1cm,蠟封管口,直立，4℃冰箱保存；保藏時間：1～2年。現代發酵技術3、砂土管保藏法適用于產孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細菌原理：人工模擬自然環境，將微生物吸附在載體上，干燥后保藏；方法：將砂與土以確定比例混合，裝入小試管滅菌，接種，抽真空干燥低溫保藏；保藏時間：1～10年。現代發酵技術4、懸液保藏法適用于絲狀真菌、酵母型真菌及細菌中的腸道菌。基本原理：將微生物懸浮于不含養分的溶液如蒸餾水、0.25M磷酸緩沖液（Ph6.5）或生理鹽水中寡養分保藏。保藏時間：約1年。現代發酵技術5、真空冷凍干燥保藏法原理：低溫、干燥、缺氧；方法：制備菌懸液，與疼惜劑混合，置于安瓿管，低溫下快速將細胞凍結，再抽真空使水分升華，密封，低溫保存；保藏時間：5～10年。現代發酵技術6、低溫保藏法原理：－20℃低溫菌體代謝緩慢；方法：制備菌懸液1-2ml入密封性能較好的螺旋口試管－20℃保藏保藏時間：1～10年。現代發酵技術7、液氮超低溫保藏法原理：超低溫，菌體新陳代謝停止；方法：將菌種加入滅菌后的10%甘油或5%二甲基亞砜（DMSO）疼惜劑中，密封于安瓿管，先降至0℃，再緩慢降至－35℃，再置于液氮罐保存；保藏時間：永久。現代發酵技術ATCC應用的菌種保藏法冷凍干燥保藏法和液氮保藏法可達到最大限度地削減傳代次數和避開菌種衰退保藏程序：先將原種制成若干液氮保藏管保藏,再制一批冷凍干燥保藏菌種作分發用。經5年后,假定第1代(原種)的冷凍干燥保藏菌種已分發完畢,就再打開一瓶液氮保藏原種至少在20年內,凡獲得該菌種的用戶,至多只是