油籽中有機氮類農藥殘留檢測引言我國歷來是植物油籽的生產和消費大國，2005全國植物油籽總產量達到5234.8萬噸，接近世界總產量的15%，是僅次于美國的第二大植物油籽生產國：同時，各類植物油籽的年消費量超過7000萬噸，接近世界總消費量的20%。此外，歐盟仍然是我國植物油籽的最大出口市場，2006年我國對歐盟的植物油籽的出口量和出口額為20.9萬噸和1.477億美元，分別占總出口量和總出口額的22.84%和34.8g%，出口產品以花生、芝麻等為主。日本作為我國植物油籽的第二大出口市場。而油料作物生產過程中為防治病蟲草害使用的多種農藥，再加上前茬作物土壤中的農藥殘留，這些因素都會造成油籽中農藥殘留。特別是近年來因農藥殘留量超標遭到退貨和超標預警而引發的花生國際貿易爭端事件越來越多，如對進口的中國花生日本、歐盟等總將農藥殘留作為第一檢測目標，各國對進口油籽類農藥殘留量的規定。這不僅限制了我國油籽及產品的對外出口貿易，造成大量資源浪費，而且還影響了我國油籽在國際上的良好聲譽。既暴露出我國油籽及制品的質量管理滯后，也對油籽進入國際市場制造了技術障礙。因此，制定、修訂和完善油籽農殘限量及測定標準，科學合理地使用農藥才能實現油籽產業的綠色和可持續發展。目前，農藥殘留分析是一種對復雜混合物中痕量組分的分析技術，它要求精細的微量操作手段，包括提取、凈化、濃縮、定性及定量等過程，其中樣品前處理技術的好壞關系到分析結果的準確性，在整個分析過程中起著非常重要的作用，也是目前分析化學領域研究的熱點之一.特別是針對油籽中的含油量高、許多大分子化合物與目標農藥分子量相似等這些都給色譜測定帶來一定的困難，因此本章重點討論如何在加速溶劑萃取除去部分油脂及凈化過程一凝膠滲透色譜如何更為有效的除油脂。本章以乙腈為提取劑，應用加速溶劑萃取技術對幾種油籽中種有機氮類農藥進行提取，并對加速溶劑萃取條件如萃取溶劑種類、萃取分散劑的選擇等進行了優化，在此基礎上，運用凝膠滲透色譜技術對提取劑進一步凈化，并對凈化柱、流動相及接收時間做出優化，建立了油籽中九種有機氮類農藥同時分析的新方法，并應用于油籽中農藥殘留分析，效果較好。3.2實驗部分3.2.1主要儀器與試劑Agilent6890氣相色譜儀，配有氮磷檢測器(NPD)；DIONEX加速溶劑萃取儀ASE200；J2凝膠滲透色譜儀；微波儀意大利公司JFSD-100粉碎機.；R-200旋轉蒸發儀；TurboVapll型氮吹濃縮儀(美國Caliper公司)；BP21ID型十萬分之一電子天平。乙腈、丙酮、二氯甲烷、環己烷、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純。弗羅里硅土(農殘級，使用前650°C灼燒后轉到130°C烘箱保持，使用前超純水去活化)。中性氧化鋁(農殘級，使用前650C灼燒后轉到130C烘箱保持，使用前超純水去活化).涕滅威(Aldicarb)、殺線威(Oxamyl)、除蟲脲(Diflubenzuron)、抗蚜威(Pirimicarb)、乙硫甲威(Ethiofencarb)、殺草丹(Thiobencarb)、甲霜靈(Metalaxyl)、二甲戊樂靈(Pendimethalin)，滅螨猛(Chinomethionate)農藥標準；。第3章加速溶劑章取.凝膠滲透色譜.氣相色譜法檢測油籽中有機氮農藥殘留3.2.2實驗方法3.2.2.1標準儲備液的配制用丙酮將各種標準物質配制成10pg/mL?40pg,mL的混合標準溶液，于4°C冰箱中保存.3.2.2.2色譜條件DB-XLB毛細管柱（60mX0.25mmX0.25um,膜厚）：進樣口溫度：245C:程序升溫：柱溫在60C保持Imin，以25C升至150C，停留Imin，再以5C升至240C，停留8min;進樣量：lpL，不分流進樣：載氣為N2。3.2.2.3樣品制備將油籽樣品于粉碎機中粉碎，山茶籽、大豆過40目篩備用，其中花生、芝麻含水分較多，不易過篩。3.2.2.4樣品提取稱取樣品5.09.加入到34mL的萃取池中，并加入279中性氧化鋁粉除油。所用溶劑為乙腈，溫度100C，壓力為1600psi，預熱5min，靜態萃取5min，用溶劑快速沖洗樣品兩次，沖洗液體積為樣品池體積的45%，氮氣吹掃收集全部提取液，加上系統清洗液，總計每個樣品用溶劑35mL，耗時13min。提取液于旋轉蒸發器上蒸發濃縮至盡干，乙酸乙酯?環己烷（50:50，v/用定容至10mL。3.2.2.5祥品凈化將上述濃縮液過凝膠色譜凈化柱（填料為中性多孔的聚苯乙烯二乙烯基苯微球體的Bio-BeadsS-X3）（22g，33cmX1.9cm），流動相為乙酸乙酯.環己烷=（50:50，VN）溶液，流速4.7mL/min;收集第18-35min流出的液體。旋轉蒸發濃縮至約lmL，用N2吹除溶劑，以正己烷定容至lmL，留待GC分析。3.3結果與討論3.3.1儀器條件優化3.3.1.1色譜柱選擇氣相色譜柱有非極性及極性等條件的制約，在實際應用中表現出各自的優缺點。毛細管柱的極性根據含有聚硅氧烷的多少來決定的，由于聚硅氧烷用途廣泛、性能穩定性，是目前最常用的固定相.為了改善柱子的性能，常采用鍵合和交聯的方式。交聯是將多個聚合物鏈單體通過共價鍵進行連接，鍵合是將其再通過共價鍵與管壁表面相連。這樣處理的結果使得固定相的熱穩定性和溶劑穩定性都有較大的提高。所以，鍵合交聯固定相色譜柱可以通過溶劑的浸洗，從而去除柱內的污染物。HP-5:5%=苯基-95%=甲基聚硅氧烷表示其包含有5%的苯基集團和95%的甲基集團（“二”是表示每個硅原子包含有兩個特定集團），對芳香族化合物有更好的選擇性。鍵合交聯技術使得HP-5毛細管色譜柱具有極高的柱效和非常低的柱流失率，并有非常長的柱壽命。DB-XLB:超常的低流失，弱極性溫度限擴展到340/3600C獨特的選擇性，對活性化合物惰性優異，是理想的驗證分析用色譜柱，非常適用于農藥、除草劑、多氯聯苯和多環芳烴的分析.DB-XLB高溫下抑制色譜柱流失效果很好.DB-1701:14%氤丙基苯基（其中7%氤丙基7%苯基），86%二甲基聚硅氧烷，氤丙苯基的存在使锝色譜柱具有中等極性，具有很廣的應用范圍。鍵合交聯技術使得DB-1701毛細管色譜柱具有極高的柱效和非常低的柱流失率，并有非常長的柱壽命。根據上述毛細管柱的性質結合目標藥物藥物不同的極性分別選取具有代表性質的弱極性毛細管柱及中等極性的毛細管柱在相同的色譜條件下實驗，結果表明：DB-1701毛細管柱殺線威分解，除蟲脲無響應。HP-5毛細管柱中抗蚜威與乙硫甲威重合，改變升溫程序依然不能得到很好的分離效果。DB-XLB毛細管柱分離效果良好，9種農藥基本可達到完全分離。3.3.1.2進樣口溫度的確定少數農藥對熱光敏感、易分解、不可測定，包括本實驗中的氨基甲酸酯類農藥等等。因此，根據九種農藥的溶沸點及其極性的大小，溫度范圍在230C?270C。根據圖表可明顯得出：進樣口溫度在230°C及245T，各農藥氣化完全，有較好的響應值。當進樣口溫度在270C時，有部分農藥已經分解。而考慮到處理后的基質中仍然會殘留少許油脂，會對毛細管柱造成損害，因此將溫度設定為245C以提高油脂的氣化率，將對柱的損害降到最低。3.3.2提取溶劑的選擇九種農藥其物理性質、化學性質不盡相同，如：抗蚜威遇強酸堿易分解，乙硫甲威熔點過低等，這些都會給提取、凈化及檢測帶來困難。在提取劑的選擇上，本研究重點考察了丙酮、乙腈。經提取、濃縮后稱重發現：同等條件下，丙酮提取的殘渣量大約是乙腈的兩倍，這遠不利于下一步的凈化。而采用乙腈后，不但可以很好的沉淀蛋白質，且溶出雜質少，對大分子基質其有一定的沉降作用。因此，本實驗選擇乙腈作為提取溶劑。3.3.3提取方式的選擇3.3.3.1傳統及ASE提取方式比較基質大豆、花生、芝麻等油籽類作物，其成分均以油脂含量居高但含水量、蛋白量均不相同，在制備過程中發現：同樣的攪拌機制樣，可制得大豆、山茶籽粉狀物、花生顆粒狀、芝麻碎渣狀，且花生、芝麻均不得過篩處理。因此，經過實驗比較得出：大豆、花生、山茶籽等用傳統及ASE提取，其殘渣量前者遠大于后者.且由于傳統方式提取費時、費試劑，處理一個樣品需溶劑50mL，分3次提取，至少需25min。而ASE提取一個樣品大概需用乙腈35mL。僅需13min便可提取完畢。并且ASE萃取的整個操作處于密閉系統，減少溶劑揮發對環境的污染，和環境的相容性好.因此，本章選用ASE作為提取手段。 ^3.3.3.2ASE分散劑的選擇ASE萃取時，為了使樣品更好的分散，一般需選擇樣品分散劑，擴大與提取劑的接觸和節省溶劑。通常多選用硅藻土或無水Na2S04、石英砂做分散劑與樣品充分混合。本實驗根據樣品中含有大量的油脂的特性，選擇比較了硅藻土、弗羅里硅土、中性氧化鋁作為分散劑吸油效果的比較，結果見圖3.5。硅藻土、弗羅里硅土、中性氧化鋁均有一定的吸油效果，但在等量情況下，其吸油效果依次增強。在一定情況下，除油效果與分散劑的質量呈正相關的關系，但當中性氧化鋁量達到279時，其吸油量達到飽和。凝膠滲透色譜法因其無可逆吸附，再生能力強，所以適用于分離的樣品都能完全洗脫，且能反復使用，一般填料可使用3—5年，其自動化程度也較高。但由于柱內徑較大，溶劑耗費量也較大，因此，本實驗首先選擇凈化柱的長短對分離效果的影響，選擇柱長分別為（32X19mm）和（15X19mm）作比較。可以看出，長柱除油效果明顯高于短柱，且在樣品芝麻的量達到59時達到飽和，同時也反映出：長柱的除油量可達到2.Og左右，短柱除油量可達到0.8g左右。當樣品殘渣量不大于0.8時，短柱是較好的選擇。3.3.4.2流動相的選擇（1）流動相對樣品影響由于分子形狀、大小以及凝膠阻滯作用的不同也可能導致樣品分離不完全，一些小分子干擾物可能被夾帶洗脫到農藥中，較大分子量的農藥則會提前流出，影響回收率。本實驗就不同流動相體系對芝麻樣品淋洗效果做出說明。將芝麻提取殘渣0.29避GPC，分段接收，旋轉蒸發儀上旋至近干，分析天平上稱重。（2）流動相對標準物質影響據文獻報道，用乙酸乙酷提取糙米中50種有機磷農藥殘留，GPC凈化，環己烷?二氯甲烷（50:50，VN）作為淋洗劑，GC/NPD檢測。方法檢出限為0.001?0.089mgjkg，平均回收率在70%?120%，相對標準偏差為1.7%-18.g%。為了考察聚苯乙烯凝膠SX-3對目標農藥的分離凈化，本實驗將9種農藥混合標樣直接過凝膠色譜柱，分別用環己烷?二氯甲烷、環己烷，乙酸乙酯溶液作淋洗液，以4.7mUmin的流速洗脫，每lmin流出液收集于單個試管中，分別用氣相色譜檢測各段流出液中農藥的含量，結果見3.8.通過比較兩圖可知：在兩種不同體系的流動相下，各種農藥的回收率均在85%—110%問，均可用做GPC凈化的流動體系。但通過觀察可知：在環己烷，氯甲烷體系中農藥除蟲脲、殺線威在700s時均已流出80%左右，滅螨猛在700s?lOOOs時有少部分流出。而通過圖3.6可以看出，樣品中90%油脂流出均在lOOOs之前，因此，本實驗中，環己烷，氯甲烷體系不適合用做GPC凈化體系中的流動相，且二氯甲烷的毒性相較之乙酸乙酯要大，因此，本章選擇環己烷一酸乙酯作為流動體系。3.3.5大豆基質效應實驗中發現，經過GPC凈化后，得到樣品顏色為黃色，GC測定后發現對農藥甲霜靈有干擾，經過GC/MS測定后確定為干擾，通過調試程序升溫后氣象色譜儀仍不能有較好的分離效果，需要過SPE小柱對樣品進一步凈化，實驗采用了PSA、Carb-Envi柱、Florisil柱，添加回收見表3.10。根據表3.10得出：Envi-Carb柱對色素處理較為徹底，樣品接近透明，但滅螨猛被完全吸附，洗脫劑的極性從非極性的環己烷到極性較大的乙腈仍不能將滅螨猛洗脫，這可能與Envi-Carb柱會完全吸附平面剛性結構的化合物，通過觀察可知滅螨猛正是此種結構.Florsil柱在洗脫劑的極性為非極性時，基本可達到清除色素的目的，但涕滅威基本無回收。當洗脫劑中有少