植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)七第一頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)七植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定

第二頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：基礎(chǔ)驗(yàn)證型實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的變化，在一定程度上可以判斷逆境對(duì)植物的危害程度和植物對(duì)逆境的抵抗力，也可作為植物抗旱育種、抗寒育種的一項(xiàng)生化指標(biāo)。2.學(xué)習(xí)測(cè)定脯氨酸含量的基本原理和方法。第三頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日二實(shí)驗(yàn)原理在正常環(huán)境條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量較低，但在逆境（干旱、低溫、高溫、鹽漬等）及植物衰老時(shí)，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游離脯氨酸積累量與逆境程度、植物的抗逆性有關(guān)。因此，測(cè)定植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量，在一定程度上可以判斷逆境對(duì)植物的危害程度和植物對(duì)逆境的抵抗力。

采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡(jiǎn)便，而且不受樣品狀態(tài)（干或鮮樣）限制。

第四頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色縮合物，此縮合物在520nm處有最大吸收峰，可以用分光光度法測(cè)定。第五頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日三主要儀器、試劑、實(shí)驗(yàn)材料儀器設(shè)備：分光光度計(jì)，水浴鍋，試管，試劑:12.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6M磷酸以3:2混合，作為溶劑進(jìn)行配置，攪拌加熱（低于70℃）溶解，冷卻后置棕色瓶中，4℃保存可使用2~3d。

2甲苯，3%磺基水楊酸溶液。

3脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取25mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶解，蒸餾水定容至250mL（100μg/mL）。再取10ml用蒸餾水釋定容至100ml（10μg/mL）。材料：植物葉片。第六頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日四實(shí)驗(yàn)步驟1．脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：按下表操作管號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸/ml00.20.40.81.21.62.0H2O/ml2.01.81.61.20.80.40冰乙酸/ml22222223%磺基水楊酸/ml2222222顯色液/ml4444444脯氨酸含量/μg0248121620混勻后在沸水浴加熱60min，冷卻，向各管加入4ml甲苯，充分震蕩30S，靜止片刻，以萃取紅色物質(zhì)，待分層后吸收甲苯層以0號(hào)管為對(duì)照在520nm下比色，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。第七頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日2樣品的測(cè)定

（1）脯氨酸的提取：稱(chēng)取待測(cè)葉片0.5g，加5ml3%磺基水楊酸研磨，勻漿移至離心管中，在沸水浴中提取10min，（提取過(guò)程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后3000r/min離心10min。（2）吸取0.2ml提取液于另一干凈的試管中加1.8ml，加2ml冰醋酸及4ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱60min，溶液即呈紅色。冷卻，向各管加入4ml甲苯，充分震蕩，以萃取紅色物質(zhì)，靜止待分層后吸收甲苯層以0號(hào)管為對(duì)照在520nm下比色，得吸光度值。第八頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日五結(jié)果計(jì)算式中：C：由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸的質(zhì)量，μgV：提取液總體積，mLa：測(cè)定液體積，mLW：樣品質(zhì)量，g第九頁(yè)，共十一頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)配置的酸性茚三酮溶液僅在24h內(nèi)穩(wěn)定,最好現(xiàn)用現(xiàn)配.茚三酮的用量與脯氨酸的含量相關(guān).一般當(dāng)脯氨酸含量在10ug/ml以下時(shí),顯色液中茚三酮的濃度要達(dá)到10mg/ml,才能保證脯氨酸充分顯色.

測(cè)定樣品若進(jìn)行過(guò)滲透脅迫處理,結(jié)果會(huì)更顯著.

此法也可用于干樣品中脯氨酸含量的測(cè)定.第十頁(yè)，共十一頁(yè)，202