淺析AngⅡ對腹膜間皮細胞ROS和NADPH氧化酶亞基p47phox表達的影響及黃芪的干預作用的論文【內容摘要】目的探討angⅱ對腹膜間皮細胞ros和nadph氧化酶亞基p47phox表達的影響及二代腹膜間皮細胞經黃芪注射液(agi)預處理后的干預作用。方法體外培養sd大鼠原代腹膜間皮細胞至2代，靜止24h后，隨機分為：正常對照組(a組)，angⅱ(10-7mol/l)組(b組)，angⅱ+agi(2g/ml)組(c組)，angⅱ+agi(1g/ml)組(d組)。用熒光染料(dcf)及激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內活性氧(ros)。rt-pcr檢測nadph氧化酶亞基p47phox的表達。western印跡檢測p47phox的蛋白表達。結果①angⅱ可顯著增加大鼠腹膜間皮細胞ros產生，刺激20min后，ros的表達較對照組顯著上升(p0.05)。agi可顯著抑制angⅱ刺激后ros的產生,且agi對ros的抑制程度與agi的濃度呈正相關，b組、c組、d組三組比較后差異顯著(p0.05);②大鼠腹膜間皮細胞經angⅱ刺激后，nadph氧化酶亞基p47phoxmrna和蛋白的表達均上升，agi可抑制angⅱ誘導的p47phoxmrna的表達上調，c、d兩組分別與b組比較后差異顯著(p0.05)。結論angⅱ可誘導大鼠腹膜間皮細胞產生的ros增加、nadph氧化酶亞基p47phox表達上調;agi可抑制nadph氧化酶的表達和活性及ros的產生，從而為agi防治腹膜纖維化提供了理論依據。11665【本文關鍵詞語】腹膜間皮細胞;血管緊張素ⅱ;活性氧;nadph氧化酶;黃芪abstract:objectivetoexploretheeffectsofangiotensinⅱonthereactiveoxygenspeciesofperitoneummesothelialcellsandexpressionofnicotinamide-adeninedinucleotidephosphate(nadph)oxidasesubunitp47phoxaswellastheroleofastragalusinjection(agi)interventionforsecond-generationperitoneummesothelialcells.methodsprimaryratperitoneummesothelialcellswereculturedintothesecondgenerationinvitro.aftersynchronizationfor24hours,thecellswererandomlyassignedtocontrolgroup(groupa),angⅱ(10-7mol/l)group(groupb),angⅱ+agi(2g/ml)group(groupc),andangⅱ+agi(1g/ml)group(groupd).thedcf-sensitivecellularroswasmeasuredbyfluorometricassayandconfocalmicroscopy.rt-pcrwasemployedtodetectthemrnaexpressionofnadphoxidasesubunitp47phox,andp47phoxproteinexpressionwasexaminedbywesternblot.results①angⅱsignificantlyinducedtheproductionofintracellularroscomparedwithcontrol(p0.05).afterstimulationfor20minutes,rosexpressionincreasedsignificantlycomparedwiththatincontrolgroup(p0.05).agiinhibitedangⅱ-inducedrosgeneration,andtheinhibitoryeffectwaspositivelycorrelatedwithitsconcentration.groupsb,candddifferedsignificantlyfromeachother(p0.05).②angⅱstimulatednadphoxidasesubunitp47phoxmrnaandproteinoverexpressions,andagiinhibitedtheup-regulationofp47phoxmrnaoverexpression.groupscanddwerecomparedwithgroupb,respectively(p0.05).conclusionangⅱcansignificantlyinducetheproductionofratperitoneummesothelialintracellularrosandup-overexpressionofnadphoxidaseandcellularrosgeneration,whichprovidestheoreticalbasisforagispreventionofperitonealfibration.keywores:peritoneummesothelialcell;angiotensinⅱ;reactionoxygenspecies;nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate(nadph)oxidase;astragalus腹膜纖維化是長期腹膜透析(peritoneumdialysis,pd)患者的重要并發癥之一，最終導致腹膜結構異常、喪失超濾功能而退出腹膜透析。高糖腹膜透析液可引起腹膜發生氧化應激反應，導致腹膜結構和功能異常。近年研究證實，血管緊張素ⅱ(angiotensinⅱ,angⅱ)參與了腹膜間皮細胞的轉分化和細胞外基質的積聚，與腹膜纖維化的發生發展密切相關[1-2];煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,nadph)氧化酶作為活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)的調控酶，其胞漿亞基p47phox在多種組織的氧化應激反應中起著樞紐性作用[3-4]。調節nadph氧化酶亞基p47phox的表達及活性成為改善氧化應激狀態、防治腹膜纖維化的重要切入點。色譜指紋圖譜證實黃芪注射液有穩定的清除自由基、抗氧化的色譜峰[5]，超微結構證實黃芪注射液能拮抗高糖環境對腹膜間皮細胞的氧化應激損傷[6-7]。為此，本研究應用黃芪注射液來觀察angⅱ對腹膜間皮細胞的影響，以探討angⅱ對腹膜間皮細胞ros和nadph氧化酶亞基p47phox等表達的影響、及黃芪的干預作用，為腹膜纖維化防治提供新的思路。1材料與方法1.1主要試劑胎牛血清(fbs)、dmem/f12干粉培養基(gibco公司);胰蛋白酶(amerasco公司);angiotensinⅱ(sigma,usa);黃芪注射液(正大青春寶藥業生產，國藥準字z33020179，每支10ml相當于原材料20g);h2-dcfda(molecularprobes,usa);trizol試劑(invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(fermentas公司);taqdna聚合酶(fermentas公司);rnase抑制劑(gibcobrl公司);焦碳酸二乙酯(depc，博彩公司);dnamarker(dl2000，takara公司);瓊脂糖(biolabs公司);兔抗大鼠p47phox抗體(upstate公司，usa);兔抗大鼠gapdh抗體(dako公司，denmark);bca法蛋白濃度測定試劑盒(pierce公司);temed(sigma公司)，其余化學試劑為國產分析純。1.2大鼠腹膜間皮細胞的分離與培養[8]健康清潔級雄性sd大鼠，體重180～220g，由河南科技大學機能實驗中心提供，每只肌肉注射100ml/l水合氯醛約0.6～1.0ml。待麻醉后向大鼠腹腔內注射20～30ml2.5g/l胰蛋白酶+0.2g/ledta消化液。2h后斷頸處死大鼠，750ml/l酒精全身浸泡消毒5min。將大鼠仰面放置于超凈工作臺上，沿腹白線依次剪開腹壁皮膚及肌肉，吸出腹腔內液體，移入15ml離心管中。1500r/min離心15min，棄上清，加入含100ml/lfbs的dmem/f12培養液，輕輕用吸管吹打使之成為細胞混懸液，分裝于25cm2的細胞培養瓶中。再加入培養基使之總體積達到4～5ml，放入條件為37℃、950ml/l空氣、50ml/lco2的細胞培養箱中培養。每3d更換一次培養基。免疫組織化學方法鑒定結果示細胞角蛋白(cytokeratin)陽性，將2代腹膜細胞隨機分為以下4組：正常對照組，angⅱ(10-7mol/l)刺激組，兩組用無血清的dmem/f12培養基培養;黃芪注射液高濃度(2g/ml)干預組，黃芪注射液低濃度(1g/ml)干預組，兩組提前孵育1h進行干預處理。在合適的時間點，觀察以上各組各指標的變化情況。1.3細胞內ros的測定ros的測定按文獻報道方法[9]。具體如下：將細胞傳至激光共聚焦專用培養皿(corning公司)，靜止24h同步化后，krh緩沖液清洗3次，將各組細胞用10mg/lh2-dcfda避光孵育37℃15min，krh緩沖液再清洗3次，激光共聚焦顯微鏡觀察，激發波長488nm，發散波長505nm，攝像。測定各組熒光強度值，并以對照組熒光強度為基線，計算其他各實驗組相對熒光強度值。1.4實時定量rt-pcr檢測總rna提取按照trizol試劑說明書操作。取2μg總rna按反轉錄試劑盒說明書合成cdna。用實時定量pcr儀(美國mjresearch)檢測mrna的表達。定量pcr反應體系：sybrgreenmix7.5μl，引物各0.3μl，cdna1.0μl，加三蒸水補足至15μl。反應條件：94℃預變性5min，92℃變性15s，60℃退火并延伸1min，共40循環，72℃終末延伸10min。pcr產物于12g/l瓊脂糖凝膠電泳fluorechemtm8900凝膠成像系統成像，以目的基因與內參照gapdh積分吸光度的比值作為定量值進行統計分析。引物序列見表1。表1實時定量pcr的引物序列tab.1primersforrtq-pcr基因引物序列產物長度1.5western印跡按文獻報道方法[11]。取各組細胞，pbs洗2遍，加入細胞裂解液，收獲蛋白質，4℃，12000r/min，離心15min，bradford法測定濃度。取適量的蛋白質標本，100g/l丙烯酰胺(sds)凝膠上電泳，電壓90v30min，140v60min。室溫恒壓100v維持90min。麗春紅染色硝酸素纖維膜，觀察蛋白轉移結果。tbst洗膜：室溫下10min。50g/l脫脂奶粉阻斷：室溫下輕搖60min。tbst洗膜：室溫下10min×3次。抗原抗體免疫反應加入tbst稀釋的p47phox(1∶500)或gapdh(1∶1000)抗體孵育：4℃搖床輕搖過夜。tbst洗膜：室溫下10min×3次。分別與辣根過氧化物共軛的抗-兔的ⅱ抗(1∶1000)及hrp-anti-biotin抗體(1∶1000)室溫下孵育1h。tbst洗膜：室溫下10min×3次。顯影、檢測ecl發光。室溫下將膜浸于發光劑中1min后，取出膜甩去多余液體，將硝酸素纖維膜置于兩張干凈的保鮮膜之間，在暗室中對著x-線膠片曝光0.5～30min不等。膠片投入自動洗片機中沖洗和烤干。于凝膠成像系統進行目的蛋白及內參照gapdh條帶灰度分析。1.6統計學處理應用spss17.0統計軟件進行分析。吸光度分析采用單位面積計算機圖像掃描值減去背景值的均值表示信號強度，以gapdh作為內參照，計算兩者吸光度的比值，并以對照組或0h組作為基準，計算其他各實驗組相對吸光度值，以±s表示。組間比較采用單因素方差分析和snk-q檢驗。p0.05為差異有統計學意義。2.1大鼠腹膜間皮細胞的鑒定培養的大鼠腹膜間皮細胞呈菱形、橢圓形、多邊形等，細胞融合后，呈典型的鋪路石樣。免疫組化結果示細胞角蛋白(cytokeratin)陽性。在angⅱ10-7mol/l濃度作用12h后，rpmcs失去原來的整齊排列，細胞間隙增寬，但細胞形態未出現明顯的改變(圖1)。圖1腹膜間皮細胞的形態fig.1morphologyofperitonealmesothelialcells(×200)a：正常大鼠腹膜間皮細胞的形態;b：血管緊張素ⅱ刺激后大鼠腹膜間皮細胞的形態。2.2angⅱ對ros產生的影響及黃芪的干預作用激光共聚焦顯微鏡觀察dcf熒光強度代表ros產生的量。正常對照組(a組)，angⅱ(10-7mol/l)組(b組)，angⅱ+agi(2g/ml)組(c組)，angⅱ+agi(1g/ml)組(d組)，在dcf孵育20min后，ros的產生情況如下圖(圖2)。統計學分析，腹膜間皮細胞經angⅱ刺激20min后，ros產生較a組顯著增加(p0.05)。c組、d組均可顯著逆轉由angⅱ刺激誘導的ros產生增加，與b組比較，均差異顯著(p0.05)。c組與d組相比較差異顯著(p0.05)，說明ros產生的量與agi的濃度呈負相關(圖3)。圖2激光共聚焦顯微鏡dcf熒光fig.2dcffluorescentmodelunderlaserconfocalmicroscopea：正常對照組;b：angⅱ(10-7mol/l)組;c：angⅱ+agi(2g/ml)組;d：angⅱ+agi(1g/ml)。圖3angⅱ對ros產生的影響及黃芪的干預作用fig.3angiotensinⅱinfluencedrosproductionandeffectofastragalusintervention(n=4)a：正常對照組;b：angⅱ(10-7mol/l)組;c：angⅱ+agi(2g/ml)組;d：angⅱ+agi(1g/ml)組。avs.b，p0.05;bvs.c，p0.05;bvs.d，p0.05;cvs.d,p0.05。2.3angⅱ對nadph氧化酶亞基p47phox表達的影響及黃芪的干預作用實時定量rt-pcr結果顯示，angⅱ可誘導nadph氧化酶亞基p47phoxmrna表達上調，且以時間依賴模式上調，p47phoxmrna從4h開始有統計學差異(p0.05)，至12h到達峰值(圖4)。westernblot結果顯示，angⅱ可誘導p47phox蛋白表達以時間依賴模式上調，從12h開始有統計學差異(p0.05)，至48h達峰(圖5)。圖4angⅱ誘導nadph氧化酶亞基p47phoxmrna的表達情況fig.4angⅱinducednadphoxidasesubunitsp47phoxmrnaexpression(n=4)4、8、12、24hvs.0h，p0.05。圖5angⅱ誘導nadph氧化酶亞基p47phox蛋白的表達情況fig.5angⅱinducednadphoxidasesubunitsp47phoxproteinexpression(n=4)12、24、48、72hvs.0h，p0.05。pmcs經agi預處理后，再行angⅱ體外刺激，可顯著逆轉由angⅱ誘導的nadph氧化酶亞基p47phoxmrna表達上調，c組、d組分別與b組比較，具有顯著差異(p0.05)，但未觀察到c組與d組有顯著性差異，agi對p47phoxmrna表達的抑制度不依賴濃度模式(圖6)。圖6agi預處理可顯著逆轉angⅱ誘導的nadph氧化酶亞基p47phoxmrna表達的上調fig.6agipretreatmentcouldreverseangⅱ’sinductionofnadphoxidasesubunitsp47phoxmrnaexpression(n=4)a：正常對照組;b：angⅱ(10-7mol/l)組;c：angⅱ+agi(2g/ml)組;d：angⅱ+agi(1g/ml)組;avs.b，p0.05;bvs.c，p0.05;bvs.d，p0.05。3討論腹膜纖維化是腹膜透析的重要并發癥之一，對其發病機制的不斷探討、尋找新的治療靶點及有效干預劑是腹膜透析進一步發展的迫切需要。angⅱ不僅作為一種血管活性物質參與ras的活化效應過程，而且局部產生的angⅱ作為一種重要的生長因子參與調節細胞的增值、凋亡及纖維化進程，是引起腹膜纖維化的重要因子之一[10-12]。nadph氧化酶是一種過氧化物酶,廣泛存在于吞噬細胞及非吞噬細胞，其催化產物活性氧(reactlveoxygenspecies,ros)參與機體防御和信息傳遞等許多生理過程。nadph氧化酶主要由5個亞基組成，包括2個膜亞基：gp91phox、p22phox;3個胞漿亞基：p47phox、p40pox、p67phox。另外，還有2個低分子量的gtp結合蛋白rap1a和rac2。當細胞受到相應刺激后,胞漿亞基p47phox被磷酸化激活，與p67phox結合并向胞膜轉位，與胞膜亞基結合組成有氧化活性的復合體，將氧催化為-o2-，進而產生一系列活性氧，造成細胞損傷。nadph氧化酶作為ros的調控酶，其胞漿亞基p47phox在多種組織的氧化應激反應中起著始動、樞紐性作用[13-15]。如前所述，色譜指紋圖譜證實黃芪注射液有穩定的清除自由基、抗氧化的色譜峰，其拮抗高糖環境對腹膜間皮細胞的氧化應激損傷的作用已被證實。該實驗研究中，在angⅱ作用下，ros的產生明顯增加，腹膜間皮細胞nadph氧化酶亞基p47phoxmrna和蛋白結果一致，均呈時間依賴模式的表達上調。我們應用黃芪注射液預處理后發現，黃芪不僅可明顯減少由angⅱ誘導的腹膜間皮細胞ros的產生，而且可使nadph氧化酶亞基p47phox的表達降低。該實驗表明黃芪不僅能夠抑制nadph氧化酶的表達，而且可抑制其活性。由此我們推測，黃芪通過抑制腹膜間皮細胞nadph氧化酶的表達及其活性，從而減少腹膜間皮細胞ros的產生，阻斷ros在其中的信號傳導作用，及下游因子tgf-β的過度表達，減輕細胞的轉分化和細胞外基質的積聚，增加細胞外基質的降解而發揮其延緩腹膜纖維化的作用。綜上所述，長期腹膜透析患者，腹膜間皮細胞暴露于腹透液高糖、低ph值、乳酸鹽和葡萄糖降解物等多種生物不相容因素下，可導致腹膜纖維化，angⅱ、ros、nadph氧化酶均參與其中。腹膜間皮細胞經angⅱ刺激，其ros產生明顯增多。ros產生增多與其調控酶——nadph氧化酶的表達上調密切相關。黃芪注射液能夠抑制nadph氧化酶的表達，減少腹膜間皮細胞ros的產生，從而減少腹膜的氧化應激損傷，延緩腹膜纖維化的發生發展。【以下為參考文獻】\[1\]kiribayashik,masakit,naitot,etal.angiotensinⅱinducesfibronectinexpressioninhumanperitonealcellsviaerk1/2andp38mapk\[j\].kidneyint,2005,67:1126-1135.\[2\]nohh,leehb,yumr,etal.angiotensiniimediateshighglucose-inducedtgf-beta1andfibronectinupregulationinhpmcthroughreactiveoxygenspecies\[j\].peritdialint,2005,25(1):38-47.\[3\]karenb,karl-heinzk.thenoxfamilyofros-generatingnadphoxidases:physiologyandpathophysiology\[j\].physiolrev,2007,87:245-313.\[4\]hah,chamk,choihn,etal.effectsofperitonealdialysissolutionsonthesecretionofgrowthfactorsandextracellularmatrixproteinsbyhumanperitonealmesothelialcells\[j\].peritdialint,2002,22(2):171-177.\[5\]張磊，聶磊，王唯紅.黃芪注射液色譜指紋圖譜與抗氧化作用的相關分析\[j\].中藥材，2009,32(11):1757-1760.\[6\]舒靜，王怡，張曉云.黃芪注射液拮抗高糖腹膜透析液對腹膜間皮細胞緊密連接的影響\[j\].上海中醫藥大學學報,2007,21(4):50-53.\[7\]徐家云，王俊霞，孟曉青，等.黃芪注射液對大鼠腹膜透析效能及腹膜超微結構的影響\[j\].河南科技大學學報,2006,24(2):81-83.\[8\]yangx,yer,kongq,etal.cd40isexpressedonratperitonealmesothelialcellsandupregulatesicam-1production\[j\].nephroldialtransplant,2004,19(6):1378-1384.\[9\]zhangz,yuanw,sunl.1,25-dihydroxyvitamind3targetingofnf-κbsuppresseshighglucose-inducedmcp-1expressioninmesangialcells\[j\].cultrev,2007,72(2):193-201.\[10\]rhyudy,yangyq,hah