微生物的遺傳變異與菌種第一頁，共三十一頁，2022年，8月28日本章主要內容微生物遺傳變異的基本原理?關于微生物遺傳變異的物質基礎及其存在形式。?關于微生物基因突變的基本原理（類型、特點和機制）。?關于微生物基因重組的基本原理（方式和特點）。微生物菌種的選育

?關于野生型微生物菌菌株分離、篩選與純化。

?關于微生物的誘變育種的工作程序和方法步驟。

?

關于營養缺陷型突變菌株的篩選方法和具體應用。

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原生質體融合育種技術的操作程序。

?基因工程育種技術的操作步驟和取得的成就。

?

微生物菌種退化的原因；掌握菌種復壯的方法、防止菌種退化的措施以及菌種保藏的方式和原理。第二頁，共三十一頁，2022年，8月28日第一節微生物遺傳變異的物質基礎

證明核酸是遺傳變異物質基礎的經典實驗

肺炎雙球菌的轉化實驗噬菌體的感染實驗煙草花葉病毒的拆開與重組實驗

第三頁，共三十一頁，2022年，8月28日肺炎雙球菌的轉化實驗

注射R型活菌

小鼠不發病（存活）

注射S型滅活菌

小鼠不發病（存活）注射S型活菌

小鼠發病死亡注射R型活菌+S型死菌

小鼠發病死亡

心血分離到S型活菌

(2)

細菌培養試驗熱致死S型菌

培養皿培養

無菌落生長

R型活菌

培養皿培養培養出R型菌落

熱致死S型菌+R型活菌

培養皿培養培養出大量R型和S型菌落R型活菌+S菌抽取提物

培養皿培養培養出大量R型和S型菌落⑴動物試驗第四頁，共三十一頁，2022年，8月28日噬菌體的感染實驗

1952年侯喜(A.Hershey)和蔡斯(M.Chase)利用示蹤元素，對大腸桿菌T2噬菌體進行了這類實驗。先用含有35S和32P兩種元素的培養基培養大腸桿菌，然后讓T2噬菌體侵染培養后的大腸桿菌，從而使T2噬菌體打上35S和32P的標記。

讓這種T2噬菌體侵染不含標記元素的大腸桿菌，并在T2噬菌體完成了吸附和侵入后，

強烈攪拌洗滌，以便使吸附在菌體外表的T2噬菌體蛋白質外殼脫離細胞并均勻分布，再進行離心沉淀，分別測定沉淀物和上清液中的同位素標記。結果發現，幾乎全部35S都在上清液中，而幾乎全部32P和細菌一起出現在沉淀物中。第五頁，共三十一頁，2022年，8月28日煙草花葉病毒的拆開與重組實驗

1956年，美國的法朗克-康勒特(Fraenkel-Conrat)將煙草花葉病毒拆成RNA(因該病毒不含DNA)和蛋白質，并分別對煙草進行感染實驗；結果發現只有RNA能感染煙草，并在感染后的寄主中分離到完整的具蛋白質外殼的煙草花葉病毒。后來他又將甲、乙兩種變種的煙草花葉病毒拆開，在體外分別將甲病毒的RNA和乙病毒的蛋白質結合，將乙病毒的RNA和甲病毒的蛋白質結合進行重組。接著他把這些經過重組的病毒分別感染煙草。結果從寄主分離所得的病毒蛋白質均取決于相應病毒的RNA。證明了核酸(RNA)是煙草花葉病毒的遺傳物質基礎。第六頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、遺傳物質在細胞中的存在方式

（一）細胞水平從細胞水平來看，細胞核；除此之外，在細胞質中存在著一些能自我復制的遺傳物質，一般稱這部分DNA為質粒。（二）亞細胞核水平真核微生物的細胞核有核膜包圍，形成具有完整形態、在光學顯微鏡下清晰可見的細胞核，核內DNA與組蛋白結合在一起構成染色體。（三）分子水平

DNA（RNA）－－→在DNA大分子上存在著決定某些遺傳性狀的特定區段，即所謂基因－－→一個基因含若干核苷酸堿基組成的三聯密。四種核苷酸，按其排列組合方式的不同，可編出三聯密碼43＝64個，用于決定組成蛋白質的20種氨基酸順序。起始密碼（AUG）和終止密碼（UAA、UGA和UAG）。

第七頁，共三十一頁，2022年，8月28日第二節

微生物的基因突變一、基因突變的類型

基因突變的類型是多種多樣的，按突變體表型不同，可分為以下幾種類型：（1）形態突變型。

（2）條件致死突變型。

（3）營養缺陷突變型。

（4）抗性突變型。

（5）抗原突變型。（6）其他突變型。二、基因突變的特點

整個生物界，由于它們遺傳變異的物質基礎是相同的，因此顯示在遺傳變異的本質上都具有相同的規律，這在基因突變的水平上尤其突出。

（1）不對應性。

（2）自發性。

（3）稀有性。（4）獨立性。（5）誘變性。（6）穩定性。（7）可逆性。三、基因突變的機理（一）誘發突變及其機理1堿基對的置換⑴直接引起置換的誘變劑（亞硝酸類、烷化劑類）

⑵間接引起置換的誘變劑（堿基類似物）2移碼突變

3染色體畸變（二）自發突變的機制

1背景輻射和環境中多因素低劑量的誘變效應

2微生物自身代謝產物的誘變效應

3互變異構效應4環狀突出效應第八頁，共三十一頁，2022年，8月28日堿基對的置換堿基對的置換可分成兩個亞類：一類是DNA鏈上的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換，稱為轉換；另一類是DNA鏈上的一個嘌呤被另一個嘧啶或是一個嘧啶被另一個嘌呤所置換，稱為顛換

A：TT：A

AT

C：GG：C

CG

雙鏈DNA

單鏈DNA

（實線代表轉換，虛線代表顛換）第九頁，共三十一頁，2022年，8月28日直接引起置換的誘變劑亞硝酸是一種對含有氨基的堿基對直接作用而誘發堿基對轉換的誘變劑。它能使堿基中的氨基氧化脫氨，從而使腺嘌呤（A）變成次黃膘呤（H），胞嘧啶（C）變成尿嘧啶（U），而后由于H和C配對，U與A配對，因此當DNA再次復制時，A:T就轉換為G:C，而G:C就轉換為A:T。

H:C

↗

H:C-→G:C

↗

H:C→G:C↗

A:T→H:T-----→A:T亞硝酸類引起的堿基對置換

O:A

T:A（顛換）

O:C

G:C（復原）

G:CRG:CO:C

O:T

A:T（轉換）

O:G

C:G（顛換）烷化劑是誘變育種極其重要的一類誘變劑，它們的化學結構都帶有一個或多個活性烷基。所有這些物質通過烷化磷酸基形成烷化嘌呤和烷化嘧啶與DNA作用，特別是經常形成烷化鳥嘌呤。烷化作用導致基因突變的機制尚未定論。①堿基類似物作用，引起堿基配對的錯誤。②烷基在鳥嘌呤引起脫嘌呤作用，使鳥嘌呤從DNA鏈上脫落下來，進而引起DNA復制時堿基對的缺失和置換。。第十頁，共三十一頁，2022年，8月28日間接引起置換的誘變劑

A:BU/G:BrU

↗

G:BrU

--→G:C

5-BU↗A:T-－→A:BU-----→A:T

(a)

G:BrU/A:BU

↗

A:BU----→A:T

5-BrU↗G:C----→G:BrU-----→G:C

(b)

5-溴尿嘧啶的誘變效應

a.5-BU以酮式摻入；

b.5-BrU以烯醇式摻入

5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鳥嘌呤（8-NG）、α-氨基嘌呤（α-AP）及6-氮嘌呤（6-NP）等。它們的作用是通過活細胞的代謝活動摻入到DNA分子中后，引起堿基對的置換，因此是間接的。在這些堿基類似物中，最常被應用的是5-溴尿嘧啶（5-BrU）和α-氨基嘌呤（α-AP）。5-BrU是T的代謝類似物。5-BrU以酮式狀態時可以替代T，與A配對；5-BrU以烯醇式狀態時替代C與G配對；5－BrU可以通過烯醇式和酮式結構的變化；引起堿基對置換。第十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日移碼突變移碼突變這是指由一種誘變劑而引起DNA分子中的一個或少數幾個堿基插入或缺失，從而使該部位后面全部遺傳密碼發生轉錄錯誤的一類突變。吖啶類染料及其化合物是移碼突變的有效誘變劑，例如三氨基吖啶，吖啶黃，吖啶橙，5-氨基吖啶。

吖啶類化合物的誘變機制目前還不很清楚。現普遍認為，由于吖啶類化合物是一種平面型三環分子結構，與一個嘌呤:嘧啶堿基對相似，因此能夠嵌入兩個相鄰的DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開，從而在DNA復制過程中，會使鏈上插入或缺失一個堿基，結果引起移碼突變。第十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日染色體畸變染色體畸變是指由誘變劑引起DNA分子的大損傷，它包括染色體結構上的缺失、重復、易位及倒位等。紫外線、X射線、γ射線等射線及亞硝酸、烷化劑等均能引起染色體畸變，尤其是紫外線能引起DNA分子多處較大的損傷。紫外線主要通過在同鏈DNA相鄰的嘧啶間或在互補雙鏈間形成以共價鍵結合的胸腺嘧啶二聚體。微生物能以多種方式去修復被紫外線損作后的DNA，主要方式有兩種：

（1）光復活作用由于微生物中一般都存在著光復合作用，因此，用紫外線照射菌液時都須在紅光下進行操作處理微生物，而后在暗室或用黑布包起來培養。

（2）暗修復作用。也稱切除修復作用。

X射線和射線為電離輻射，含有很高的能量，能產生電離作用，因而能直接或間接地改變DNA結構。直接的效應是堿基的化學鍵，脫氧核糖的化學鍵和糖—酸相連接的化學鍵斷裂；

第十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日第三節微生物的基因重組

基因重組又稱為遺傳重組，它是指把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經過遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳型個體的過程。

重組是分子水平上的概念，可以理解成是遺傳物質分子水平上的雜交，而一般所說的雜交是細胞水平上的概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交一種形式。真核微生物中的有性雜交，準性生殖以及原核微生物中的轉化、轉導、接合和溶原轉變等都是基因重組在細胞水平上的反映。第十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日一、原核微生物的基因重組

受體菌直接吸收來自供體菌的DNA片段，通過交換組合把它整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的部分遺傳性狀的現象，稱為轉化。轉化后的受體菌，稱為轉化子。供體菌的DNA片段稱為轉化因子。

只有處于感受態的細菌才能接受轉化因子，進行轉化作用。轉化過程大致是這樣的：①

從供體菌提取出轉化因子雙鏈DNA片段；②

雙鏈DNA片段與感受態受體菌的細胞表面特定位點結合；③

在結合位點上，雙鏈DNA中的一條單鏈逐步降解，同時另一條鏈逐步進入受體細胞。④進入受體細胞的DNA單鏈與受體菌染色體組上同源區段配對，而受體菌染色體組的相應單鏈片段被切除，并被進入受體細胞的DNA單鏈所取代，于是形成了雜種DNA區段；⑤受體菌染色體進行復制，其中雜種區段被分離成兩個，一個恢復，一個形成一個轉化子。

（一）轉化（transtormation）第十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日一、原核微生物的基因重組

通過缺陷型噬菌體或溫和型噬菌體為媒介，將供體細菌細胞中DNA片段攜帶到受體細菌細胞中，從而使受體細菌獲得供體細菌的某些遺傳性狀的現象，稱為轉導。

根據媒介噬菌體的不同，轉導分普遍性轉導和局限性轉導兩類。

1．普遍性轉導由缺陷型噬菌體誤包（而非整合）供體細菌DNA中的任何一部分片段（包括核外遺傳物質在內）后，當它再次感染受體細菌時，使后者獲得了這部分遺傳性狀的現象，稱為普遍性轉導。它的轉導頻率為105～108。

2．局限性轉導由溫和噬菌體侵染而形成的某一溶源細菌群被誘導裂解時，其中極少數個體的DNA可能與噬菌體DNA發生若干特定基因的交換，從而被整合到噬菌體的基因組上，當該噬菌體再次感染受體細菌時，就使受體細菌獲得了這一特定遺傳性狀的現象，稱為局限性轉導，它的轉導頻率為10-6。（二）轉導（transduction）第十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日一、原核微生物的基因重組

通過供體細菌和受體細菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過程，稱為接合（有時也稱雜交）。

在細菌中，接合現象研究最清楚的是大腸桿菌。發現能夠進行接合現象的大腸桿菌有雄性與雌性之分，而決定它們性別的是由是否存在F因子所決定。

F因子又稱致育因子，是一種質粒，分子量為5×107

道爾頓；

雌性細菌不含F因子，稱為F

-

菌株，

雄性細菌含有游離存在的F因子，稱為F

+

菌株，當雄性細菌細胞中所含的F因子被整合在細胞核的DNA上，不呈游離狀態存在稱為Hfr菌株（高頻重組菌株）；

有時被整合在細胞核DNA上的F因子，從DNA上面脫落下來，呈游離存在，但在脫落時，F因子有時能帶一小段細胞核DNA。我們將這種含有游離存在的但又帶有一小段細胞核DNA的F因子的細菌稱為F′菌株。

接合的基本過程滾環復制模型接合的結果：

F++F-2F+

F′+F-2F′Hfr+F-多種情況

Hfr+F-Hfr＋F-（多數情況下）

Hfr+F-Hfr＋Hfr（少數情況下）

（三）接合（conjugation）第十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日一、原核微生物的基因重組宿主菌在感染溫和噬菌體后，由于噬菌體DNA整合到核DNA后，導致宿主菌某些新的遺傳性狀表達，即所謂溶源性轉變。這是一種與轉導相似但又有本質不同的現象。溶源轉變與轉導在本質上的不同，首先是它的溫和噬菌體不攜帶有任何供體菌的基因，其次這種噬菌體是正常的完整的，而不是異常情況下產生的缺陷型噬菌體。

溶源轉變的典型例子是不產毒素的白喉棒狀桿菌（Lorynebatceriumdiphthariac）菌株被噬菌體侵染而發生溶源化時，會變成產毒素的致病菌株。其他如沙門氏菌、紅霉菌、鏈霉菌等也具有溶源轉變的能力。（四）溶源性轉變第十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、真核微生物的基因重組在微生物的有性繁殖過程中，不同的性細胞間的接合，并隨之發生染色體的重組，從而產生新遺傳型后代的現象，稱有性雜交。凡是能產生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能進行有性雜交。有性雜交在生產實踐中被廣泛用于優良品種的培育。例如用于酒精發酵的酵母菌和用于面包發酵的酵母菌同屬一種啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的兩個不同菌株，面包酵母的特點是對麥芽糖及葡萄糖的發酵力強，產生CO2

多，生長快；而酒精酵母的特點是產酒率高而對麥芽糖、葡萄糖的發酵力弱，所以釀酒廠生產酒精后的酵母，不能供面包廠作引子用。通過兩者的雜交，就得到了既能生產酒精，又能將其殘余菌體用作面包廠和家用發面酵母的優良菌種。（一）有性雜交第十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、真核微生物的基因重組準性生殖是一種類似于有性生殖但比它更為原始的一種生殖方式。是由兩個非異配型核的細胞接合后，形成異核體細胞，兩核能發生低頻率的接合與交換，產生具有新性狀的個體。其主要過程包括以下基本過程：1．菌絲聯結發生在一些形態上沒有區別的，但在遺傳性狀上可以有差別的兩個同種親本的體細胞（單倍體）間。2．形成異核體兩個單倍體細胞經聯結后，使原有的兩個單倍體核集中到同一個細胞中，形成雙相的異核體。異核體能夠獨立生活。3．核融合在異核體中的雙核融合，產生雙倍體雜合子核。核融合后產生雜合子核的頻率也是極低的，如構巢曲霉和米曲霉為10-5～10-7

。4．體細胞重組和單倍體化雙倍體的雜合子極不穩定，在進行有絲分裂過程中，極少數核中的染色體會發生染色體交換和單倍體化，從而形成了極個別的具有新遺傳性狀的單倍體雜合子。（二）準性生殖第二十頁，共三十一頁，2022年，8月28日

第四節微生物的菌種選育在微生物工業應用中，微生物菌種工作主要包括以下四方面：①菌種的分離篩選：挑選符合生產要求的菌種，這是選種工作的任務。②菌種培育：改良已有菌種的生產性能，使產品的質和量不斷提高，或使它更適應于工藝的要求，這是育種工作的任務。③菌種的保藏：一切生產菌種都要使它避免死亡和生產性能的下降，這是菌種保藏工作的任務。④退化菌種的復壯：如果發現菌種的生產性能下降，就要設法使它恢復，這便是菌種復壯工作的任務。第二十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日一、從自然界中分離篩選菌種的方法步驟采樣

增殖培養

純種分離純培養生產性能測定方法、地點、時間和周圍環境記錄純種分離的原則就是使培養物獲得單個菌落：1．稀釋分離法2．平板劃線分離法

⑴

涂菌：

⑵

劃線分離：①分步劃線法；②一次劃線法：

3．組織分離法

測定代謝產物或其它目的性狀第二十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日（一）誘變育種的一般步驟和方法

出發菌株

同步培養

使菌細胞處于相同或接近的生理狀態

單細胞（或單孢子）菌懸液的制備

單細胞或單孢子的意義

酵母或霉菌孢子106/ml、細菌108/ml

誘變劑的選擇及其劑量的確定

以致死率為90％～99％為宜

誘變處理

①物理誘變劑

②化學誘變劑確定出發菌株

↓菌種的純化選優

↓←出發菌株的性能鑒定同步培養

↓制備單細胞（或單孢子）懸液

↓←活菌濃度測定誘變劑的選擇與確定誘變劑量的預試驗

↓誘變處理

↓平板分離

↓計形態變異的菌落數，計算突變率挑取疑似突變菌落純培養

↓突變體的初步篩選

↓←用簡單快捷的方法重復篩選

↓←搖瓶發酵試驗選出突變體（根據情況進行生產試驗或重復誘變處理）二、微生物的誘變育種第二十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、微生物的誘變育種（二）變異菌株的初步篩選

紙片培養顯色法

透明圈法瓊脂塊培養法

第二十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日1篩選用培養基⑴基本培養基：凡是能滿足某種野生型菌株營養要求的最低成分的合成培養基，稱為基本培養基；常以‘[-]’表示；⑵在基本培養基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質如蛋白胨、酵母膏等，以滿足該微生物的各種營養缺陷型菌株都能生長繁殖的培養基，稱為完全培養基，常用‘[+]’表示；⑶在基本培養基中只是有針對性地加入某一種或某幾種營養缺陷成分，以滿足相應的營養缺陷型生長的培養基，稱為補充培養基，補充培養基可按所加入營養成分相應地用‘[A]’、‘[B]’等來表示。（三）營養缺陷型突變體的篩選及其應用

二、微生物的誘變育種2．營養缺陷型菌株篩選的一般方法

（1）誘變劑處理（2）淘汰野生型菌株①抗生素法②菌絲過濾法（3）檢出營養缺陷型

（4）鑒定營養缺陷型

第二十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日檢出營養缺陷型①夾層培養法②限量補充培養法③影印接種法

④

逐個檢出法

第二十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日鑒定營養缺陷型①含營養缺陷型菌株的基本培養基平板的制備。②營養缺陷型營養類別的鑒定。③缺陷型菌株單一營養因素的鑒定。

20種氨基酸的排列編組

第一組第二組第三組第四組第五組第六組第七組第八組第九組丙氨酸谷氨酸亮氨酸絲氨酸精氨酸谷氨酰氨賴氨酸蘇氨酸天冬酰氨甘氨酸蛋氨酸色氨酸天冬氨酸組氨酸苯丙氨酸酪氨酸半胱氨酸異亮氨酸脯氨酸

纈氨酸第二十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日原生質體融合育種

細胞（A+B—）

細胞（A—B+）

脫壁處理

脫壁處理

原生質體（A+B—）

原生質體（A—B+）

混合

加融合劑

原生質體融合

涂平板（原生質體再生）

形成菌落

檢出重組子菌落（A+B+）第二十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日轉基因工程菌株的構建1．提取目的基因用密度梯度離心方法分別從供體細胞中提取所需要的DNA即目的基因和作為載體的細菌質粒或噬菌體核酸，目的基因也可通過化學方法人工合成。2．處理目的基因根據基因工程的“設計藍圖”的要求，在從供體細胞中提取出的