關于蛋白質的表征第一頁，共三十四頁，2022年，8月28日第一節蛋白質結構的基本概念蛋白質是一類重要的生物高分子，英文為“Protein‘’，該詞從希臘文轉化而來，意思是“最原始的”，可見當時人們對蛋白質的認識已有相當的基礎。蛋白質有成千上萬種，不同的蛋白質具有不同的生物功能。蛋白質是20種α—氨基酸通過酰胺鍵(肽鍵)聯成的長鏈分子，這種長鏈即所謂的肽鏈。許多蛋白質還包含有非肽鏈結構的其他組成成分，這種成分稱為配基或輔基。作為蛋白質組成成分的氨基酸一共有20種，它們的名稱和結構列在表1.1中。為了表達蛋白質和肽結構的需要，每個氨基酸都有相應的符號表示，常用符號通常由氨基酸英文名的三個字母組成。一個蛋白質由上百個甚至上千個氨基酸組成，為了表達的方便，又設計出單字符號。第二頁，共三十四頁，2022年，8月28日

除了列出的20種基本氨基酸外，實際上還有幾百種不常見的氨基酸參與某些蛋白質的組分，可稱為稀有氨基酸；另一些氨基酸出現頻率要高些，如羥脯氨酸、甲基組氨酸和甲基賴氨酸、丁—羧基谷氨酸等，但它們是在蛋白質生物合成后轉變而來的，因此不計入基本氨基酸之列。第三頁，共三十四頁，2022年，8月28日這是一個鏈狀的結構，經水解后，將肽鍵斷裂，轉變成一系列的氨基酸。鏈中相當于氨基酸的單元結構稱為殘基。而上述鏈稱為肽鏈。肽鏈的氨基一端稱為N端或氨基端，羧基一端稱為C端或羧基端。習慣上將N端列在左邊，C端列在右邊。

第四頁，共三十四頁，2022年，8月28日從氨基酸的結構看，半胱氨酸的側鏈上有巰基(一SH)。巰基的穩定性較差，在堿性pH下易氧化成二硫鍵。如果一條肽鏈上的兩個半胱氨酸的巰基形成二硫鍵，肽鏈形成鏈內二硫鍵。假如兩條肽鏈間形成二硫鍵，就出現由兩條肽鏈組成的蛋白質(如胰島素)。蛋白質分子有兩對以上的二硫鍵，或者是蛋白質分子有一對二硫鍵和一個半胱氨酸，二硫鍵可能有不同的連接方式，于是出現了異構體。異構體的數目因半胱氨酸含量不同而異，但是在天然的蛋白質分子中沒有這種異構體，只有一種連接方式。而在重組蛋白質的復性中，可能出現二硫鍵的錯配對。第五頁，共三十四頁，2022年，8月28日

一級結構是指肽鏈中的氨基酸排列序列，二硫鍵的定位也是一級結構的重要內容。蛋白質的二級結構也可稱為構象單元，因為它們是蛋白質復雜的空間構象的基礎。一些構象單元的結構不是不可改變的，pH、溫度、溶劑極性等環境因素可以影響單元的變化。具有二級結構的肽鏈在空間走向，形成具有空間三級結構的蛋白質，如所謂球蛋白類，它們幾乎都有生物功能和活性，其中有些還能進一步相互作用，形成更高層次的結構。蛋白質之所以有功能，是因為分子表面有可以進一步作用的基團，不同的蛋白質由于分子表面結構不同，可作用的基團分布和組合也不同，這種特定的結構就是各種蛋白質具有不同的功能和活性的分子基礎。四級結構可以認為是一些特定三級結構的折疊肽鏈通過非共價鍵而形成的大分子體系，也可稱為亞基的裝配(assembly)。裝配是一個非常復雜的過程，它能使各亞基間相互調節，使蛋白質分子的功能更完善。

第六頁，共三十四頁，2022年，8月28日

蛋白質的分離純化是研究蛋白質的基礎和起點。蛋白質的來源是多樣的，主要來自動物、植物的各種組織和微生物，取材要采用含量豐富的器官。抽提蛋白質的第一步是將組織粉碎，破壞細胞，以便于抽提出蛋白質；抽提液的選擇也因蛋白質而異。一般用低濃度的緩沖液，有時在從肌肉抽提時也用稀堿，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的pH卻是中性的。在提取膜蛋白或包含體內的蛋白質時，還加入(非離子型)表面活性劑或變性劑以增加溶解度。各種細胞中普遍存在各種蛋白水解酶，會導致蛋白質的降解，低溫操作和加一些相應蛋白酶抑制劑(如DFP、PCMB、PMSF等)、螯合劑(EDTA等)是有益的。將蛋白質抽提出來后，就要進一步純化。純化不外乎兩方面：一是將大體積變成小體積；二是把多組分蛋白質只留下單一種的蛋白質。前者有吸附法、超濾法、凍干等。后者有根據蛋白質的分子形狀和分子質量大小、電離性質、溶解度和疏水性、生物功能專一性等，常用有各種鹽析法、超離心沉降、結晶、電泳、凝膠過濾，離子交換色譜、親和色譜等。近年來發展的FPLC和HPLC大大促進了許多蛋白質在毫克級的純化，其量足夠用于蛋白質的化學研究。第七頁，共三十四頁，2022年，8月28日第二節蛋白質的純度

蛋白質的純度是一個重要的指標，尤其在重組蛋白的質量控制中。但它也是一個相對的指標，而純度要求95％、99％或99.9％需根據實際要求而制定。蛋白質的純度一般指是否含有其他雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、十二烷基硫酸鈉(SDS)等小分子在內。一些蛋白質在硫酸銨糊中相當穩定，一些酶在甘油中保存則很穩定。蛋白質純度如用百分數表示，有時還和檢測方法、定量方法、所選用儀器的參數有關。例如在HPLC分析蛋白質純度時，一般要求以280nm檢測，這是蛋白質的吸收高峰，而很可能不是非蛋白質雜質的紫外吸收峰，甚至小分子物質在280nm處沒有吸收，因此都以280nm的光吸收來定量處理，檢測不到非蛋白質雜質和小分子物質的存在，表明所得的蛋白質純度會偏高。在色譜中普遍采用積分面積的方法，這也不是很妥當的。而且在用計算機或積分儀在線檢出時，儀器的參數設置與所得的報告很有關系，設置不妥往往導致結果不夠準確。第八頁，共三十四頁，2022年，8月28日目前常用的鑒定蛋白質純度方法有：①聚丙烯酰胺凝膠電泳和十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)；②毛細管電泳(CE)；③等電聚焦(IEF)；④高效液相色譜(HPLC)，包括凝膠過濾、各種反相色譜、離子色譜、疏水色譜等；⑤質譜(MS)。一些新的有效方法也在引入分析蛋白質的純度，如質譜等。由于它測定分子質量的精確度可達萬分之一，因此丟失一個氨基酸殘基(平均分子質量約110Da)就可以檢出；如有氨基酸的取代形成突變株(可能分子質量有幾十道爾頓的差異)，也非常容易被發現。第九頁，共三十四頁，2022年，8月28日按照嚴格的要求，用電泳法證明蛋白質的純度，在一種pH下電泳說明該蛋白質是純的，這是不夠充分的。應該取兩種pH緩沖液，它們分布在蛋白質等電點的兩側，在這兩種pH下電泳都證明此蛋白質是純的，這樣才可靠。應該指出，只用一種方法鑒定蛋白質純度是不夠的，至少應該用兩種以上的方法，而且是兩種不同的分離機理的方法來判斷蛋白質純度才比較可靠。因為常常發現某一樣品在凝膠過濾中是純的，而在離子色譜中卻分辨為兩個組分，反之亦然。又如，一種樣品用凝膠過濾法和SDS—PAGE電泳證明是純的，但這仍不充分，因為這兩種方法的機制是相同的。第十頁，共三十四頁，2022年，8月28日第三節蛋白質的定量測定蛋白質的量是研究蛋白質的最基本的一步，而對蛋白質定量方法的原理、適用范圍、靈敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。溶液中蛋白質的濃度測定方法很多，最早的經典方法是克氏定氮法，因為每一種蛋白質都有其恒定的含氮量(14％～16％)。其方法是將一定量的蛋白質用濃硫酸消化分解，使其中的氮變成銨鹽，再與濃NaOH作用，使氨氣放出而被吸收于標準酸液中，用反滴定法滴定殘余的酸，或用硼酸吸收后，再用標準酸直接滴定，求得該蛋白質樣品中的含氮量。此法雖有普遍性，但操作繁瑣，目前應用較少。稍后應用較廣泛的方法是雙縮脲法、福林—酚法和紫外吸收法，近年來大多數人用考馬斯亮藍法。選擇哪一種方法，一般考慮的原則是準確、操作方便、影響因素少第十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、光吸收法蛋白質在280nm左右有吸收高峰，這主要是由于蛋白質中的芳香族氨基酸(Trp和Tyr)的緣故，因此可以用280nrn光吸收值來定量溶液中的蛋白質。但是每種蛋白質中的芳香族氨基酸含量是不同的，而且有較大的差別。最簡單的方法是采用280nm光吸收為1時等于lmg/ml來計算。這樣簡單的處理在準確性上有不足之處，但其測定時間短，用量極少，而且不消耗樣品，故被廣泛采用。最準確的方法是用蛋白質的摩爾消光系數計算。在蛋白質純化后，將此純的蛋白質對水充分透析，然后凍于或在真空干燥器中干燥，繼而在105℃下恒重，精確稱量1—10mg，再定量溶于一定體積中(通常為1mg/ml)，測量280nm下的光吸收，從而得出該蛋白質的摩爾消光系數。這種方法最為方便、準確，適于微量測定。第十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、考馬斯亮藍G—250法此法適合于定量10～100μg，操作簡單，應用廣泛。考馬斯亮藍G-250又叫“home—made”試劑，每個實驗室可以方便地自行配制。三、雙縮脲法此法是基于蛋白質之肽鍵一CD-NH--有雙縮脲反應，在堿性溶液中與Cu2＋絡合顯藍色。該法受蛋白質之特異性影響較小，適用于較大量蛋白質(毫克級)的測定。四、福林一酚法此法靈敏度和準確性都較高，但操作較繁瑣，此外，影響因素(譬如去垢劑干擾這一方法)也較多。Smith提出一種新的BCA測定蛋白質的方法，靈敏度和重復性均佳，受干擾少，Pierce公司有商品供應。第十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日第四節蛋白質的脫鹽(除去鹽和非共價結合的小分子)用凝膠過濾法(SephadexG-25或類似的介質)和HPLC的凝膠柱脫鹽。應用這類技術時首先要考慮蛋白質的回收，特別對少量蛋白質，尤其是堿性蛋白質，則常常因載體對蛋白質的吸附作用而導致回收差。此時的流動相一般不能用水，而推薦用0.1mol/L醋酸或0.1mol/L碳酸氫銨，因為可以在凍干過程中除去這些揮發性的鹽。在蛋白質純化的最后階段，常用揮發性溶劑(例0.1％TFA/ACN)的反相HPLC，則可得到無鹽的蛋白質樣品。如果對某些蛋白質的回收低，建議用短柱(例PE-ABD公司的RP-300柱，30mmX2.1mm)較為理想。比HPLC更簡單的方法是用C-18的Sek-Pak，或用Millipore公司的超濾離心過濾管，但耗費較大。第十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日如果蛋白質是用SDS純化的，則非共價結合的分子往往可以有效地除去，但又引入了SDS和其他一些分子(Tris，Glycine等)。從SDS電泳的凝膠中回收蛋白質的方法很多，但不盡如人意。如采用電印跡，往往很有效。因為PVDF膜結合蛋白質的親和力大大高于鹽、去垢劑等小分子物質，從而達到蛋白質脫鹽的目的。

Stone推薦用三氯醋酸(TCA)沉淀蛋白質而脫鹽，蛋白質濃度>100μg/ml(如果蛋白質濃度太低，得不到沉淀，這時可用真空離心濃縮蛋白質的方法)，加總體積1／9的100％TCA，TCA最后濃度為10％，在冰浴放置30rain后離心收集沉淀物，用100μl冷丙酮洗兩次，氣流干燥。

第十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日第五節蛋白質的分子質量測定近年來由于解決了分離介質的剛性問題，有了HPLC的凝膠過濾系統(例如Waters的1-60、1-125、1-250和Beckman或ToyoSoda的TSK2000SW，3000SW，4000SW)，這樣測定分子質量只需1h即可。但在一般實驗室應用的常規方法是SDSL，刊，原理是在SDS存在條件下，蛋白質表面都攜帶了大量負電荷，呈桿狀分子，在此情況下，不是根據蛋白質的電荷而是根據其分子形狀和大小來進行分離。用量為0.1～lμg，這種方法誤差為5％一10％，但極為簡便。凝膠過濾是測定完整蛋白質分子的分子質量，而SDS是測定蛋白質亞基的分子質量，同時用這兩種方法測定同一蛋白質分子質量，可以方便地判斷樣品蛋白質是否寡聚蛋白質。第十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日

較新方法是用毛細管電泳(凝膠篩分或無膠篩分)測定蛋白質的分子質量，僅需納克量，而且還可用積分儀或電腦聯機精確定量。同時此法對蛋白質的分辨率和準確性優于SDS方法。在某一批IL-3產品的分子質量測定中，用SDS得到均一的區帶，但在毛細管篩分電泳中為兩個毗鄰的峰。兩個峰的分子質量也有約1000Da的差異，教材作者進一步用質譜驗證了這一結果。最新的方法是用質譜測定蛋白質的分子質量。20世紀80年代初期，質譜用于測定分子質量的有快原子轟擊質譜和等離子體解吸飛行時間質譜。近年來，高分辨率的磁質譜可精確測定分子質量2000Da以下的多肽。到90年代，由于電噴霧質譜(ESl)有了長足的發展，可以用于測定分子質量約5萬Da的蛋白質，而且只需皮摩爾(pmol)量的蛋白質，且其精度可達0.01％。而MALDI-TOF則可測定蛋白質分子質量高達二三十萬道爾頓。第十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日圖1.1所示為ESI質譜測定細胞色素c的分子質量，右角是其電荷分布圖，據此計算出分子質量。第十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日

第七節氨基酸定量分析氨基酸分析在肽譜和點突變肽的分析中是很重要的，同時也可以是很精確的。因為這種肽通常是含5—20個氨基酸殘基的肽，又常常是以特定的某一個酸性或堿性氨基酸為C端。從氨基酸定量分析而言，分析20～30個氨基酸殘基肽的精確性要比含100～200個氨基酸殘基的蛋白質的精確性大得多。其次，酶解肽段(最常用胰蛋白酶)可用一個堿性氨基酸作基準1來計算，這樣準確性又可有所提高。在新型IL-2的制備工作中(Cys-125被Ser或Ala所取代)，利用二階微分光譜法可以方便地判別點突變的肽，然后用氨基酸分析或質譜，或序列測定來進一步確認。第十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日自從Spackman、Stein和Moore建立氨基酸自動分析方法以來，無論在方法學、儀器自動化或高靈敏度方面都有了很大的發展。氨基酸分析可以分為柱后反應法和柱前衍生法兩大類。前一種方法是將游離氨基酸經過色譜柱分離后，氨基酸再與顯色劑(茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛)作用，儀器需用專門的氨基酸分析儀或用HPLC加上柱后衍生裝置。這種方法比較穩定，因為一些可能有影響的“雜質”在柱分離過程中已與氨基酸分開，然后再各自與顯色劑作用。后一種方法是將各種氨基酸和熒光試劑先作用生成氨基酸的衍生物，然后再用柱把各衍生物分離，直接檢測衍生物的熒光，這種方法的特點是靈敏度高，檢出極限已達1pmol，且可以利用HPLC進行氨基酸分析，譬如OPA技術。缺點是熒光強度依賴時間變化，穩定性欠佳，要求控制很嚴格。近年來報道的PITC是一種很有效的柱前衍生技術，并且可以在254nm下檢測，操作簡便。第二十頁，共三十四頁，2022年，8月28日氨基酸的水解方法通常采用在5.7mol/LHCl真空狀況下110℃水解24h，也有在150℃下快速水解4h。不同條件下，各種氨基酸的回收率會有所不同，而且色氨酸會受到破壞，通常采用3mol/L巰基乙磺酸或4mol/L甲磺酸來防止色氨酸被破壞。一種新的方法是在水解樣品中加入保護劑十二烷硫醇(dodecanethiol)和EDTA，據稱色氨酸的回收率可達80％。在酸水解條件下半胱氨酸的定量很不準確，偏低嚴重。通常在酸水解蛋白質前用過甲酸氧化成磺基丙氨酸(cystemacid)；或先還原蛋白質，用碘代乙酸處理把半胱氨酸轉變成羧甲基牛胱氨酸。一種較新的方法是把蛋白質用DTT還原后，加入乙烯吡啶(4-vinylpyridine)，然后分析其衍生物。也有報道用DTDPA(3,3’—Dithiodipropionicacid)

與半胱氨酸和胱氨酸形成Cys-MPA，此衍生物能在t-IPLC中和其他氨基酸衍生物分離，故可用于準確定量半胱氨酸。第二十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日如果采用電泳法(例如SDS)分離到樣品，則很難從凝膠中洗脫下來，可采用點印跡法把樣品轉移到PVDF膜上，然后在PVDF膜上直接進行鹽酸水解和氨基酸分析稱之為原位分析(insitu)，在膜上分析氨基酸的誤差要高于常規方法。

Stein實驗室引入氣相水解法，操作方便，樣品損失少，回收率也高。目前已有把蛋白質水解、自動進樣、氨基酸分析和定量報告聯成一個系統的氨基酸分析儀商品出售。第二十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日

第八節肽譜定義：肽譜技術是指蛋白質被酶解或化學降解后肽段的分離分析或制備。

肽譜分析最早稱之為fingerprinting(指紋術)，用在血紅蛋白A(HbA)和血紅蛋白S(HbS)的分子病研究中，即將HbA和HbS分別用胰蛋白酶酶解，然后將它們的肽分別進行紙電泳，再轉動90°進行紙層析。Ingram用此法觀察到HbA和HbS之間有一個肽斑點上的差別，進一步的肽順序分析指出僅僅是一個氨基酸殘基(一個凈電荷)的差別，正常的HbA中是Glu(β－6)，異常的HbS中為Val(β—6)。該技術發展到現階段，肽譜(pep—tide-mapping)用HPLC和GEL來做，HPLC主要是用RP-HPLC根據肽的長短和疏水性質來分離，如果肽的親水性強，則柱不能滯留住這些親水性強的肽段，達不到分辨開的效果，如果某些肽的疏水性很強，往往會粘在柱上洗脫不下來，而CE有時可以避免這些弊端。近年來，隨著LCMS和CE—MS的普遍應用，使收集到的肽峰立刻得到精確分子質量的測定，這樣使肽譜的可靠性大大增加。此外，“肽質量指紋”(peptide—massfingerprinting，PMF)的出現，即用MALDI—TOF質譜直接分析蛋白質的酶解產物，多肽出現先后是按分子質量大小排列，這對于已知序列的重組蛋白質樣品的分析更加有利。第二十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日

第九節質譜

質譜在90年代的發展，特別是兩種軟電離技術的發展，使生物質譜在質譜界成為主要角色。蛋白質組學又為生物質譜提供了一個發揮才華的大舞臺。它們中首選的是MALDI-TOF，它的大容量分析、單電荷為主的測定分子質量高達30萬Da、干擾因素少，適合蛋白質組的大規模分析之需。其次ESI為主的LC-MS聯機，適于精細的研究。目前，質譜廣泛用于蛋白質的純度鑒定、分子質量測定、序列測定、肽(質)譜分析、二硫鍵、乙酰化、糖基化、磷酰化，以及非共價結合等研究中，成為研究蛋白質不可缺少的技術，具有廣闊的發展前景。以往的美國質譜年會，參加者約千余人，近年來為三四千人，其中很多是生化學家，這和ESI和TOF在生物學中的廣泛應用是分不開的。質譜年會上生物學和醫學方面的論文也由10％上升到近40％。

第二十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日對于蛋白質，質譜發展還有一個重要的功能是肽的測序，這是一個被認為很有前途的測序方法，稱為串聯質譜(Tandem-MS)，即在第一級質譜得到肽的分子離子，選取目標肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列子離子，即N端碎片離子系列(b系列)和C端碎片離子系列(y系列)，將這些碎片離子綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列。在以四級桿為質量分析器的質譜，通常是將三個四級桿串聯起來，實現二級質譜，即MS/MS，這就是所謂三級四級桿質譜。在以離子阱為質量分析器的質譜中，采用離子阱可多次捕捉母離子和子離子，因此可實現多級質譜，即MSn，一般可達五級以上，對于分子結構分析很有用處。目前的測序方法基本上是在ESI質譜上發展起來的，MALDI-TOF-MS最近發展了PSl(postsourcedecay)技術，在一定程度上可進行序列分析，但不如ESI-MS測序應用廣泛。

因此，ESI-MS可較好地與現有的蛋白質分析方法(如HPLC、CE)蛋白質測序技術相匹配。在蛋白質翻譯后修飾研究中，由于ESI-MS強大的MS/MS乃至MSn功能，可以解析蛋白質的各種修飾的位點，如糖基化、磷酸化等，以及復雜的糖鏈結構。第二十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日值得注意的是，質譜技術目前的發展非常迅猛，無論是ESI，還是MALDI-TOF，都在不斷改進，以期完善。ESI著力于提高靈敏度(如采用nanospray，capillaryLC)，以及降低鹽和去垢劑的影響；MALDI-TOF則著重于提高精確度，如在離子進入分析器前稍微停留，去除雜質，即延遲抽提(delayextraction)和加強測序功能。最近Q—TOF質譜的發展--MALDI-TOF由于其儀器的固有性能，決定其在高分子質量區域(m/z>3000)的質量精度下降，一般認為在高分子質量區域，質量偏差應不超過100ppm，否則在肽譜檢索時得不到準確的結果。Q-TOF型儀器，由于其四極桿和飛行時間質譜是以相互垂直方向幾何型組成，當離子通過四極桿后，同樣的質量而具有不同動能的離子在垂直方向上受到飛行時間質譜的推出電壓作用時，通過離子的水平方向動能差異不會對飛行時間質譜分辨率產生影響，因而其分辨率比普通MALDI-TOF要高，靈敏度也提高，顯然它的質量精度亦有顯著提高，其偏差<5ppm。這樣在蛋白質肽譜的檢索中可提高準確度。目前，Q-TOF質譜不但有ESI源，也配備了MALDI源，這無疑是如虎添翼，具有極高的分辨率和靈敏度。第二十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日第十節蛋白質及多肽的序列測定和末端分析

目前測定蛋白這一級結構的主要方法有：蛋白質化學方法(主要是Edman降解法測N端和用羧肽酶或化學法從C端測起)和從cDNA來演繹的方法。其他方法有質譜法和二維核磁共振法。

利用cDNA法測定的最長蛋白質是脫脂脂蛋白B-100(4532個氨基酸殘基)，用經典的蛋白質化學分析法測得的最大的蛋白質是人凝血體系中的VonWillebrand因子(2050個氨基酸殘基)。從蛋白質數據庫來看，約一半來自cDNA，一半來自蛋白質化學方法。雖然cDNA技術發展很快，也方便，但目前還不能取代經典的蛋白質化學方法，例如部分順序測定對識別蛋白質的功能結構域或蛋白質活性部位以及化學修飾部位，還是離不開經典的蛋白質化學方法。蛋白質的末端氨基酸與在肽鍵中間的氨基酸不同，蛋白質的一端是以α—自由基存在的，稱之為N端，習慣上列在左側；在另一端是以自由羧基存在，則稱之為C端，習慣在右側。第二十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日

1954年Sanger首先把二硝基氟苯應用于胰島素的N端測定，為研究蛋白質的精細化學結構開辟了一個新的領域，繼后Edman、Wetman-Libet、Chang等人相繼作了很多貢獻。特別應該強調指出，末端的鑒別能力較之一般的物理化學方法(色譜、電泳等)毫不遜色，有時甚至更為靈敏，所以也是鑒別蛋白質樣品純度的一種好方法。第二十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、N端分析在N端測定上，目前最經典的是異硫氰酸苯酯法‘。自1950年代建立后，在1970年代發展成一種全自動的測定方法。目前微量液相脈沖蛋白質侈肽自動順序分析儀，靈敏度約lpmol，檢出極限為20fmol，加上進行計算機數據處理和分析，既靈敏又方便。但機器有時會出現讀／寫錯誤，還是需要有經驗的工作者加以最后判斷才是最可靠的。

Wittmann-Liebold發展的雙標記法(DABITC／PITC)，用薄層分析鑒定的微量序列測定法不需昂貴儀器，可成為一般實驗室普遍采用的技術，但需要很熟練的技術才能掌握好。

N端15個序列的測定，很大程度上排除了蛋白質混淆的可能，即不太可能有兩種不同的蛋白質在N端15個序列是一樣的。這已是相當常規和公認的。如果測定蛋白質的幾個C端序列，從蛋白質的兩端來驗證，可靠性又增加了許多。再加上用MS精確測定蛋白質的分子質量，基本上是不會出差錯的。如果有肽譜或肽(質)譜，則是相當完整的鑒定工作。第二十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、C端的測定

經典的是用羧肽酶(Cp)的方法，近年來雖用CpY、CpP，但基本方法仍是一樣的，基于不同時間的C端氨基酸的釋放，是一個動態過程的演繹。先是用CpA、CpB，近來用CpY、CpP，但都不盡如人意，因為這種方法是在加入Cp后每隔一定時間間隔取一部分反應液，停止反應，用氨基酸分析測定釋放出來的游離氨基酸，以釋放氨基酸