第三章

細胞培養(yǎng)的污染和排除細胞培養(yǎng)技術細胞污染:

凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物，都應視為污染。污染微生物的污染不同細胞類型的交叉污染細菌霉菌支原體化學物質污染病毒污染途徑：

１．空氣:培養(yǎng)設施不宜置于通風場所；定期清理凈化工作臺的過濾層，防止阻塞；操作中應減少空氣流動；帶口罩；夏季潮濕季節(jié)空氣中含菌數(shù)量多，每立方米內含菌數(shù)不應超過1～5個。２．清洗消毒培養(yǎng)器皿和容器洗刷不凈殘留污物、培養(yǎng)用液滅菌不徹底等，都可引入有害物。３．操作實驗操作馬虎、動作不準確、消毒觀念不強，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口時不嚴，都可發(fā)生污染。同時培養(yǎng)兩種以上細胞，操作不慎，使用同一吸管或培養(yǎng)用液，可能導致細胞交叉污染。４．血清血清也是污染細胞的來源，有的市售血清制備水平低、檢測不嚴，常已被支原體和病毒污染。５．組織初代培養(yǎng)組織常有污染；有的是在手術中污染，有的本身可能是被污染的組織(如已經發(fā)生潰爛的腫瘤組織)；手術用碘酒消毒后，擦拭不凈可能混入碘污染污染對細胞的影響

在細胞受有害物污染時間短、污染程度輕、并能及時排除污染物的情況下，細胞有可能恢復。當污染物持續(xù)存在于培養(yǎng)環(huán)境中時，輕者細胞增殖生長緩慢、分裂相減少、細胞變得粗糙、細胞輪廓增強，重者細胞停止增殖，分裂相消失，細胞質中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓或崩潰從瓶壁脫落。1．細菌污染：細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。細菌污染后大多能改變培養(yǎng)液pH使培養(yǎng)液變混濁，毒性大的細菌很快導致細胞崩解死亡。加用抗生素的培養(yǎng)用液一般可預防和排除個別少量細菌的污染。2．真菌污染：真菌種類繁多，形態(tài)各異，在霉雨季節(jié)更易污染。真菌污染后，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁，但污染后均不難發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下觀察呈絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌呈卵圓形態(tài)，散在于細胞周邊和細胞之間生長。３．支原體污染支原體是細胞培養(yǎng)中最常見、不易被察覺和干擾實驗結果的一種污染。支原體一般過濾除菌無法去除，開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見。細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，4.病毒污染采用組織細胞培養(yǎng)法生產疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。5.非同種細胞污染

由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，操作不當，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。如“靈長類”細胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細胞的混合物，ERK/KD細胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在卻認為是HeLa細胞。真菌感染支原體污染

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細菌污染掃描電鏡法顯示支原體，附于細胞表面眾多的圓形顆粒為支原體污染的預防和排除重在預防，排除困難！1．抗生素排除法：一些有價值的細胞被污染后，可采用5～10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24～48小時，再換入常規(guī)培養(yǎng)液。有時可能奏效。2.加溫除菌

(用于清除支原體）根據(jù)支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原體污染的細胞置于41℃中作用5～10小時(最長可達18小時)以殺滅支原體。但41℃對培養(yǎng)細胞本身也有較大影響，故在處理前，應先進行預試驗，確定出最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。3.動物體內接種

受微生物污染的腫瘤細胞可接種在同種動物皮下或腹腔，借動物體內免疫系統(tǒng)消滅污染的微生物，腫瘤細胞卻能在體內繼續(xù)生長，待一定時間后，從體內取出再進行培養(yǎng)繁殖。4.與巨噬細胞共培養(yǎng)

巨噬細胞在體外培養(yǎng)條件下仍然可吞噬微生物并將其消化。利用96孔培養(yǎng)板將極少量的培養(yǎng)細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細胞、極大地降