




版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
產品經理:施真解析:干細胞的培養與鑒定
主要內容1.干細胞原代提取及鑒定2.干細胞培養體系與操作細節的重要性3.OricellTM系列干細胞產品及售后服務2原代培養過程3原代取材組織來源(個體年齡、健康狀況)
BMSC、ADSC:成人(18-45周歲)、大鼠和小鼠(4周齡)、兔和狗(1-3周齡)
NSC:大鼠(孕齡14.5天的胚胎);小鼠(孕齡12.5天的胚胎)
ESC:小鼠(見栓后3.5天的孕鼠)取材部位
BMSC:髂骨或胸骨、后肢股骨和脛骨
ADSC:抽脂手術的脂肪組織或腹股溝
NSC:胚胎大腦GE區
ESC:囊胚內細胞團45間質干細胞(MSC)定義:來源于中胚層的早期細胞,能夠分化為多種中胚層和神經外胚層來源的細胞。來源組織:骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。來源物種:人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。6廣泛存在于成年或胚胎哺乳動物大腦內可分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞。神經干細胞(NSC)7胚胎干細胞(embryonicstemcellES,細胞)是指胚泡期的內細胞團中分離出的尚未分化的、能在體外培養、具有發育全能性的早期胚胎細胞無限增殖、自我更新可分化為三個胚層來源的各種組織及細胞類型胚胎干細胞(ESC)分離細胞分離方法的選擇BMSC:密度梯度離心法(人、猴、狗)
貼壁篩選法(大鼠、小鼠、兔)ADSC:膠原酶消化法NSC:無血清培養基自然篩選法ESC:囊胚內細胞團遷移法8密度梯度離心法密度梯度離心法:不同顆粒之間存在沉降系數差時,在一定離心力作用下,顆粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同區域上形成區帶的方法。試劑:
Ficoll淋巴細胞分離液,分離出密度在1.077±0.001g/L之間的淋巴細胞9用1xPBS按照
1:1的比例稀釋骨髓;稀釋后的骨髓沿離心管壁緩慢鋪到淋巴細胞分離液上;離心;離心完畢,小心吸取中間云霧狀單個核細胞層;離心,加入培養基重懸接種;3天之后首次換液;其后,每隔2-3天換液;待細胞到80%融合的時候進行傳代。10密度梯度離心法11取大鼠/小鼠的后肢股骨和脛骨;用1mL注射器吸入培養基后沖洗骨髓腔,將骨髓全部沖洗出來;骨髓懸液進行離心;棄上清,用培養基重懸細胞,接種到1個T25或者T75培養瓶中;3天后換液,以后每隔2-3天換液,待細胞80-90%融合時傳代。貼壁篩選法擴增傳代傳代時機的控制(MSC為例)細胞匯合度的判斷傳代消化時間的控制接種密度的控制培養體系的選擇12擴增傳代-細胞匯合度的判斷(MSC)
13擴增傳代-消化時間的控制(MSC)14細胞消化15s細胞消化35s細胞消化55s不同物種、細胞類型之間接種密度有差異MSC、ADSC:2×104/cm2~4×104/cm2NSC:1.0-2.0×105cells/mLESC:1×104/cm2~2×104/cm215擴增傳代-接種密度的控制純化鑒定16純化方法:多次傳代進行純化常規檢測:細菌、真菌檢測;支原體檢測;內毒素檢測;鑒定檢測:增殖能力、生長形態、特異性抗原表達、核型分析、誘導分化能力等常規檢測17鑒定檢測共通項目復蘇存活率
臺盼藍拒染法--如果細胞膜不完整、破裂,臺盼藍染料進入細胞,細胞變藍,即為壞死。如果細胞膜完整,細胞不為臺盼藍染色,則為正常細胞或凋亡細胞。18鑒定檢測共通項目19細胞倍增時間:生長曲線測定(計數法或者CCK8法)細胞倍增的時間區間即細胞對數生長期,細胞傳代、實驗等多應在此區間進行。可在細胞生長曲線的對數生長期找出細胞增加一倍所需的時間,即倍增時間。形態學表面抗原標記多向分化能力20MSC(間質干細胞)鑒定檢測MSC(間質干細胞)鑒定檢測形態學:梭形、成纖維樣細胞原代:克隆樣生長傳代后:均質、旋渦狀排列21HumanDogMonkeyMouseRatRabbitMSC(間質干細胞)鑒定檢測表面抗原標記(流式鑒定):
MSCs屬混雜細胞群,其表面抗原也具有非專一性,它表達了間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標志,如粘附因子、生長因子和細胞因子受體以及整合素家族等。22MSC(間質干細胞)鑒定檢測23MSC(間質干細胞)鑒定檢測誘導分化能力鑒定:成骨誘導(茜素紅染色)24誘導前(匯合度65%-70%)染色前成骨誘導25MSC(間質干細胞)鑒定檢測誘導分化能力鑒定:成脂誘導(油紅O染色)26誘導前(融合度90-95%)成脂染色前誘導分化能力鑒定:成軟骨誘導(阿利新藍染色、三維培養法)27MSC(間質干細胞)鑒定檢測染色前石蠟切片后染色圖片形態學特征:可做懸浮培養或貼壁培養特異性抗原表達:Nestin分化能力:神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞28NSC(神經干細胞)鑒定檢測29大鼠神經干細胞-懸浮培養大鼠神經干細胞-貼壁培養小鼠神經干細胞-貼壁培養小鼠神經干細胞-懸浮培養NSC(神經干細胞)鑒定檢測-形態學30NSC(神經干細胞)鑒定檢測特異性抗原表達Nestin(神經干細胞標志物)陽性表達率≥75%
β3-tubulin(神經元標志物)陽性表達率
≤10%GFAP(星形膠質細胞標志物)陽性表達率≤10%GalC或OSP(少突膠質細胞標志物)陽性表達率≤10%31NSC(神經干細胞)鑒定檢測RatNSCnestinstainingMouseNSCnestinstaining分化能力自然分化
加入含血清培養液,繼續培養約7天,可分化為神經元、星型膠質細胞及少突膠質細胞。三者的分化比例約為(16±7)%,(75±7)%和(5±3)%。定向分化
1.神經元方向分化:用無血清無生長因子誘導液誘導,可使分化比例升至60%以上。2.少突膠質細胞分化:加入T3或insulin可使分化比例大大提高。32NSC(神經干細胞)鑒定檢測33神經元方向分化(TubulinStaining)星型膠質細胞方向分化(GFAPStaining)RatNSCNSC(神經干細胞)鑒定檢測34少突膠質細胞方向分化(OSPStaining)NSC(神經干細胞)鑒定檢測形態學:集落樣或克隆樣生長特異性轉錄因子/抗原表達:表達OCT-4,Nanog;SSEA種屬間表達有差異染色體結構:傳代過程中保持正常穩定的核型全能性:具有向胚胎的三個胚層來源的所有細胞分化的能力35ESC(胚胎干細胞)鑒定檢測36小鼠ES:緊密牢固結合、多層密集立體生長,呈堆積狀,邊緣清楚,細胞核大、核仁明顯、核漿比高。
人ES:相對松散、扁平狀集落,集落內細胞界限隱約可見ESC(胚胎干細胞)鑒定檢測-形態學有MEF
無MEF,無血清培養體系
特異性表達37抗原Oct-4NanogSSEA-1SSEA-3SSEA-4人ES++—++小鼠ES+++——ESC(胚胎干細胞)鑒定檢測染色體結構核型分析:正常穩定的二倍體核型,小鼠(40,XX/XY)。不隨傳代次數而改變。38ESC(胚胎干細胞)鑒定檢測39小鼠ES核型分析:40,XYESC(胚胎干細胞)鑒定檢測核型分析:顯色技術全能性體內分化:畸胎瘤實驗體外分化:EB(擬胚體)形成實驗40ESC(胚胎干細胞)鑒定檢測體內分化41將細胞注射入(約106個)SCID(重癥聯合免疫缺陷)或裸鼠體內,約4周后(人ES可能需要8~10周),可見細胞注射處有腫塊生成,處死小鼠,腫瘤固定后做石蠟包埋,切片,普通HE染色后觀察。ES可在小鼠體內生長、分化、形成含有三個胚層來源的良性畸胎瘤。ESC(胚胎干細胞)鑒定檢測體外分化42ESEB貼壁誘導約5~7天后出現自主性搏動ESC(胚胎干細胞)鑒定檢測43剛接觸干細胞,不知道該用什么培養基?費盡心血提取的干細胞養了幾代就老化了?原代取材雜細胞太多?細胞生長不均勻,有的地方密有的地方稀?操作其他細胞都沒問題,養干細胞就出現了污染?
………….干細胞培養體系與操作細節的重要性44
干細胞的研究和利用過程中,最主要的提供最適生長環境,保持培養開始時細胞群體的狀態,這就要求培養條件始終如一,近乎呆板地堅守細節和常規。
培養體系的選擇干細胞飼養員必備素質-細節決定成敗無菌意識,重中之重規范化的無菌操作超凈臺取用物品擺放、操作時細節問題環境的控制
培養箱的定期消毒、水浴鍋定期換水、大環境的控制等生物試劑使用前仔細閱讀產品說明書操作干細胞時動作輕柔復蘇、傳代、凍存等步驟重懸細胞的過程培養基使用前復溫、細胞接種之后搖勻、各種干細胞接種密度的控制、試劑保存時避免反復凍融等4546
干細胞細胞培養耗材、分子耗材培養基細胞因子
凍存液OricellTM系列干細胞產品及售后服務干細胞相關試劑及耗材47OricellTM系列無蛋白非程序凍存液4849細胞培養耗材的選擇干細胞培養板、培養瓶
(特殊TC處理表面,更適用于干細胞的貼壁培養)神經元/神經干細胞培養板
(多肽包被,無需PLL/Laminin預處理,保存時間長)15ml、50ml離心管(透明度更高、耐更高轉速)分子生物學耗材(
Labcon系列)全美進口●55周年歷史●FDA/USP認證吸頭微量離心管PCR產品系列儲樣管、儲樣架等OricellTM系列耗材Cyagen團隊特別針對免疫
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業或盈利用途。
- 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 村上河道保潔協議書
- 機關單位合同協議書
- 施工合同順延協議書
- 服裝公司入股協議書
- 棋院合伙合同協議書
- 提取維修資金協議書
- 景觀用水合同協議書
- 深圳租房防火協議書
- 2017上海中考英語試卷+答案
- 2025廠里職工安全培訓考試試題答案下載
- 弘揚與傳承中華傳統文化課件(共16張PPT)
- 《中醫護理學》第三章課件
- 泵站畢業設計
- 行政事業單位合同業務控制流程圖
- 孔子練精神聰明不忘開心方_醫心方卷二十六引_金匱錄_方劑加減變化匯總
- 板房區臨建設施技術標
- 美國AAMIST79最新修訂條款解讀----史紹毅[1]
- 危險性較大的分部分項工程清單及安全管理措施
- 理事會會議決議范文
- 通用汽車精益生產培訓資料
- 采購部管理制度與工作流程圖
評論
0/150
提交評論