10.1基因文庫的構建10.2克隆已知基因產物或核苷酸序列信息的基因10.3蛋白質功能互補克隆10.4定位克隆10.5差示減法雜交法系列10.6通過DNA全序列分析確定基因10基因文庫和目的基因的分離建立基因文庫的意義

為了深入揭示生命活動的奧秘，必須研究基因的結構、功能、表達、調控。而要對某個特定基因進行研究，又必須把這個基因分離出來。為了在龐大的基因組中準確地找出特定的基因，首先需要建立基因文庫。

基因文庫的概念

基因文庫分為基因組文庫和cDNA文庫兩種。基因組文庫是將來自一個有機體的不同隨機DNA序列片段與載體重組，轉化受體細胞，得到該物種基因組的一群重組體克隆。這些克隆的集合體即為基因組文庫，其中包含了該有機體基因組的全部序列。在這些克隆中，有序列重復和序列重疊。cDNA文庫是提取某一生物材料（組織、細胞）的總mRNAs，反轉錄成cDNAs，再與載體重組，轉化受體細胞，得到克隆的集合體。（注意沒有酶切步驟，與載體連接時的末端處理除外）基因文庫的作用是從中篩選目的基因或特定序列。圖10－1基因文庫的構建基因組文庫的內容

基因組文庫包括了基因上游調控序列、內含子、外顯子、下游序列等，如果為了研究基因的結構和表達調控，應建立基因組文庫；基因組文庫還可以用于研究不同基因在染色體上的排列情況。基因組文庫實際上是DNA文庫，它是以DNA片段為克隆對象，而不是以基因為克隆對象。

基因組文庫的大小

在建立高等真核生物的大型基因組DNA文庫時，需要克隆大量的不同DNA片段，才能以一種合理的概率獲得含有目的基因的克隆。以人β－珠蛋白基因為例，其大小約為1.5kb，而人的單倍體基因組總長度為3×106kb左右，若按片段的平均長度為1.5kb計算，理論克隆數為2百萬（3×106/1.5）。基因組文庫的大小

由于DNA片段是隨機克隆的，這個理論克隆數只是基因組文庫所需要的最小值。從統計學上講，這意味著一個只有理論克隆數的基因組文庫中含有一種特定的單拷貝基因的概率只有50%。而當基因組文庫的克隆數為2倍理論克隆數時，這個概率提高到75%。因此，為了能夠以一種合理的概率篩選出單拷貝的目的基因，一個完全的基因組文庫就必須含有3～10倍于理論克隆數的克隆。實際克隆數的計算公式

1975年L.Clarke和J.Carbon提出了一個計算一個完全基因組文庫所需實際克隆數的公式：

式中N為所需要的實際克隆數；p為在基因組文庫中出現目的基因的概率（一般要求99%）；f=DNA片段平均長度/基因組DNA總長。實際克隆數的計算

以單倍體基因組總長度為3×106kb左右為例，片段平均長度為1.5kb時，而片段平均長度為2kb時，

從式中可以看出，DNA片段平均長度越長，N值越小，所以在建立基因組文庫時，應選用大容量的載體，以減少克隆數。DNA片段的制備

純化的基因組DNA必須切割成適當大小的片段才能與載體重組，因為任何一種載體都有容量限制。選用不同的載體就要將DNA切割成相應大小的片段。DNA片段越大，包含基因組DNA全部序列的克隆數就越少。所以應選用容量大的載體。DNA片段的制備

首先要提取和純化核基因組DNA（根據研究目的，還可以是細胞器基因組DNA），在提取和純化時，盡量不要讓DNA斷裂成太小的片段。若用限制性內切酶部分消化來獲得適合某種載體攜帶的DNA片段，則DNA的初始長度應至少是用于克隆的片段的4倍，否則生成的有效片段相對較少（一端為酶切出的粘性末端，另一端為機械力造成的平端為無效片段）。DNA片段的制備

用粘粒構建基因組DNA文庫，初始DNA的長度應大于200kb；若以取代型λ噬菌體載體構建文庫，初始DNA應大于100kb。控制限制性內切酶的加入量及消化的時間，可使酶切片段成為適當的長度，對粘粒載體要求45kb左右，對取代型λ噬菌體載體要求20kb左右。DNA片段的制備

物理剪切產生適合克隆的DNA片段的方法有抽吸、高速攪拌和超聲波處理等。物理剪切的隨機性比限制酶部分消化要好，但物理剪切產生的片段與載體連接較困難。DNA片段的制備結果圖多個相同的DNA分子切割重復和重疊的片段

限制性內切酶消化或物理剪切后有些太長或太短的片段不適合克隆，應通過瓊脂糖凝膠電泳或蔗糖密度梯度離心，分離出大小適合克隆的片段，與載體重組后轉化或轉導大腸桿菌。cDNA文庫的用途

cDNA文庫含有各種mRNA的序列，含有翻譯調控序列和蛋白質的編碼序列。為了研究基因編碼區的結構或蛋白質的氨基酸序列，應建立cDNA文庫。cDNA文庫的類型

cDNA文庫一般分為表達型文庫和非表達型文庫，對于用抗體篩選或生物活性篩選，應采用表達型文庫，表達型文庫用表達型載體構建，即在外源DNA插入位點的5’上游有強啟動子，如λgt11、λZAP等；而非表達型文庫只能用DNA探針篩選，用非表達型載體構建，如λgt10，探針可根據已知氨基酸序列反推核苷酸序列人工合成，也可根據其他親源關系相近物種的同源序列合成。cDNA文庫的大小

對于高豐度的mRNA，可構建相對較小的cDNA文庫；而對于低豐度的mRNA，就應構建較大的cDNA文庫；對于極低豐度的mRNA，應先進行富集，如按mRNA大小分級、按cDNA大小分級、免疫沉淀多聚核糖體等，這樣能大大減少cDNA文庫的克隆數。文庫的大小由用來反轉錄的mRNA的量決定。cDNA文庫的制備提取和純化總mRNA以mRNA為模板，逆轉錄合成cDNA第一鏈以cDNA第一鏈為模板，合成cDNA第二鏈雙鏈cDNA與載體連接重組載體轉化或轉染宿主細胞培養、選擇陽性克隆mRNA的提取

盡量選擇目的mRNA豐度高的組織和時期提取mRNA。提取mRNA的一般方法是先提取總RNA。在液氮中研磨植物材料，然后加入提取液提取；對于動物培養細胞一般采用SDS和蛋白酶K裂解細胞后提取，而動物組織采用研磨提取。再經過各種萃取、沉淀步驟純化總RNA。

在RNA提取純化過程中，特別要注意避免RNase的破壞作用。

mRNA的提取

從總RNA中分離mRNA采用oligo(dT)12-18-cellulose柱層析法，上樣后先用上樣緩沖液（含有0.5mol/LNaCl）洗至OD260接近或等于0，再換用不含NaCl的洗脫緩沖液將結合在柱上的mRNA洗脫下來，洗脫的產物中一般有一半帶有poly（A）尾。為了進一步純化mRNA，可將產物再進行一次柱層析。圖10－3cDNA第一鏈的合成圖10－4自身引導法合成cDNA第二鏈圖10－5RNaseH法合成cDNA第二鏈圖10－6PCR法擴增cDNA雙鏈cDNA與載體的連接1.同聚物加尾連接：為了使克隆效率達到最佳，質粒和cDNA上的同聚物殘基數應當接近相等，同聚物為dA和dT時應為100個左右，為dC和dG時應為20個左右。此法不能用于λ噬菌體載體。用質粒載體構建的文庫要比用λ噬菌體載體構建的文庫更難以貯存和復制。cDNA與載體的連接2.加連接子連接：給已成平端的cDNA兩端接上連接子，再用限制酶切連接子產生粘性末端與載體連接。由于在cDNA中也可能有此限制酶的識別位點，酶切時可能會將cDNA切成兩段或更多段。要解決這個問題，可在加連接子之前先用識別該位點的甲基化酶對cDNA中可能存在的限制酶切位點甲基化，將這些位點保護起來，然后再加連接子連接。cDNA與載體的連接3.加適配子連接：由于適配子本身就帶有粘性末端，不需要再用限制酶切割，因此不會造成cDNA被切斷的情況。但在用限制酶取出外源DNA時有可能被切斷。cDNA的正確表達

對于建立表達型cDNA文庫來說，cDNA插入的方向和閱讀框的正確非常重要，若按一般方法插入，只有1/6的重組DNA能表達出正確的蛋白產物。若給cDNA兩端接上不同的連接子，載體也用相應的兩種限制酶切，則可以以正確方向插入，能表達出正確蛋白產物的比例提高到了1/3。為了提高正確表達率，還可以采用三種不同長度(相差一個核苷酸)的連接子或適配子，以保證插入片段有一個正確的閱讀框。使用λ噬菌體載體制作文庫

用λ噬菌體載體時，載體應過量，并事先除去5＇端磷酸以防止載體自身連接。經大腸桿菌DNA連接酶或T4DNA連接酶連接后，用λ噬菌體包裝蛋白體外包裝成有感染力的噬菌體顆粒，通過轉導進入宿主大腸桿菌中。λ重組載體的包裝方法

包裝的方法有兩種：一種是用兩種溶源菌的提取物混合包裝。BHB2690菌株中的原噬菌體有D基因突變，不能產生D蛋白。D蛋白位于頭部的外面，參與λ噬菌體DNA進入前頭部和頭部的成熟這兩個連續過程。D基因突變可以積累前頭部，但不能使DNA插入頭部，所以不能裂解宿主菌。BHB2688菌株的原噬菌體有E基因突變，E蛋白是頭部的主要組成成份，E基因突變不能形成前頭部，可以積累大量的各種其它蛋白，也不能裂解宿主菌。

λ重組載體的包裝方法

先在32℃培養溶源菌至對數中期，將培養溫度提高到45℃保溫15分鐘，以滅活cⅠ阻遏物并誘導裂解功能，再將細菌于38～39℃培養2～3小時，使包裝蛋白逐漸積累，然后制備細菌提取物。用超聲波破碎菌體后離心得到上清液即為提取液，這兩種細胞提取液和重組λ噬菌體DNA混合后可自動包裝成有感染力的噬菌體顆粒。λ重組載體的包裝方法

另一種方法是用一種溶源菌提取物包裝。SMR10菌株中的原噬菌體編碼有包裝所需的全部蛋白，但其cos位點缺失，誘導后產生的噬菌體DNA不能進入前頭部。包裝后轉導的效率為108pfu/μg（pfu，plaqueformingunit，噬菌斑形成單位），要比用重組λDNA直接轉染大腸桿菌高得多。目的基因的克隆用目的基因的雜交探針原位雜交，從基因文庫中分離目的基因探針的制備：①人工合成的寡核苷酸：已知蛋白質的氨基酸序列，反推出其基因的核苷酸序列，合成簡并探針。盡量避免多密碼子的氨基酸區段。②同源探針：利用目的基因在另一物種相應基因中的同源保守序列作探針。表達融合蛋白和獨立的外源蛋白

在λZAP中，多克隆位點位于lacZ‘基因之前，合成出來的融合蛋白的氨基端為外源蛋白，羧基端為半乳糖苷酶的146個氨基酸。也有一些表達載體可以表達出獨立完整的外源蛋白，如pKC30和pKK177-3，它們不產生融合蛋白，前者利用λ噬菌體的PL啟動子，熱激誘導表達；后者利用tac啟動子，它是一個trp-lac雜合啟動子，由lac阻遏物所調控，受IPTG誘導表達。目的基因的克隆2用抗體篩選表達文庫

若使用表達載體構建cDNA文庫，可以表達出各cDNA編碼的蛋白質，這種cDNA文庫叫表達文庫。將表達文庫的平板轉印到硝酸纖維素膜上，裂解細胞后酶聯免疫檢測或125I標記抗體放射自顯影檢測。可以從表達文庫中篩選出陽性克隆。此法要求宿主菌本身不合成該蛋白。

基因組文庫不能是表達文庫。酶聯免疫檢測

將菌落轉印到NC膜上，用氯仿蒸氣處理膜，使細菌在膜上裂解，或45℃高溫誘導溶源菌裂解。然后加一抗結合，酶標二抗結合，加底物顯色。雙位點檢測法

雙位點檢測法特別適合于檢測融合蛋白：可把抗A-B融合蛋白A部分的抗體固定在固體基質上，最簡單的方法是將抗A抗體直接涂抹在聚乙烯平皿上，然后將已裂解的轉化菌轉印到此平皿上，這時A-B蛋白通過A部分與平皿上的抗A抗體結合。再加放射性125I標記的抗B抗體，這些抗體結合到A-B蛋白的B部分。最后放射自顯影，從原菌落復制平板上挑選陽性克隆。目的基因的克隆3用識別位點探針篩選表達文庫

特定序列的雙鏈DNA經標記后，可用于篩選能與該序列特異結合的DNA結合蛋白。如用啟動子上的順式元件篩選與之結合的轉錄因子。目的基因的克隆4蛋白質功能互補尋找目的基因

用突變體宿主菌，此宿主菌因某基因突變，帶有容易檢測出的缺陷表型，若用攜帶外源該正常基因的表達型載體轉化，可使宿主菌的缺陷表型得到糾正，即為蛋白質功能互補。其理論基礎是有些基因產物在不同的生物種中能發揮同樣的功能。常用的宿主菌是營養缺陷型宿主菌。圖10－8經酵母功能互補分離血紅素生物合成的鐵螯合酶基因(1)圖10－8經酵母功能互補分離血紅素生物合成的鐵螯合酶基因(2)定位克隆

如果不知道某個基因的核苷酸序列和其表達產物的氨基酸序列，也沒有其表達產物的抗體，只知道它造成的表型特點，就可以采用定位克隆的方法來尋找該基因。定位克隆可以搞清楚基因在染色體上的位置及相鄰基因的位置關系，也可以找到被不同克隆分割開的一個完整的大基因。

酵母人工染色體

為了減少染色體步查時的工作量，要求基因組文庫的克隆數少為好，因此要求每一個克隆的外源DNA片段要大。酵母人工染色體（Yeastartificialchromosome,YAC）也是一種DNA載體，與外源DNA重組后轉化酵母菌，在宿主菌內的表現和染色體一樣，可以復制和分配到兩個子細胞中去。YAC可以克隆很大的DNA片段（200～500kb）。pYAC4的特點①一對來自四膜蟲染色體的端粒(TEL)②一段來自酵母染色體的著絲粒序列(CEN4)③一段控制酵母染色體復制的自主復制序列(ARS1)④在酵母菌中的選擇標記(左臂TRP1和右臂URA3，可與營養缺陷型宿主菌互補而篩選)⑤在大腸桿菌中的復制起點(Ori)⑥在大腸桿菌中的選擇標記(ampr)⑦插入失活標記(SUP4)⑧一些限制酶切位點，其中位于SUP4中有一個EcoRⅠ位點用于插入外源DNA。YAC文庫構建的基本步驟基因組DNAYAC文庫構建的基本步驟YAC文庫的構建和篩選

pYAC4在大腸桿菌中擴增，提取出來后用BamH1及EcoRⅠ切割，分離純化兩臂，除去兩BamH1位點間的短片段。用小牛腸堿性磷酸酶CIP處理脫去兩臂的5＇磷酸以避免載體自身連接。加入用EcoRⅠ部分消化并經脈沖電泳分級的基因組DNA片段（contigs，重疊群），連接酶連接，轉化受體酵母菌，在選擇培養基中選擇陽性克隆（紅色菌落）。YAC文庫的構建和篩選

選擇培養基缺色氨酸和尿嘧啶，被YAC轉化了的酵母菌能在選擇培養基上生長。選用的受體菌帶有ade2赭石突變基因，ade2編碼有關腺嘌呤合成的一個必需酶（磷酸核糖氨基咪唑羧化酶），該酶突變后腺嘌呤不能合成，從而積累腺嘌呤的前體磷酸核糖氨基咪唑（粉紅色），使菌落成粉紅色。YAC載體中帶有SUP4，這是tRNATyr赭石校正基因，載體轉化受體菌后，代謝正常，形成白色菌落。若有外源DNA插入SUP4中，不能校正赭石突變，形成紅色菌落。三種終止密碼子的別名UAAochre赭石密碼UAGamber琥珀密碼UGAopal蛋白石密碼染色體步查的基本原理和步驟

根據遺傳圖譜，選擇與目的基因連鎖并相距最近的分子標記開始，此標記稱為旁側標記（flankingmarkers），常用的分子標記是RFLP和RAPD。一旦鑒別出了最緊密連鎖的旁側標記后，步查就可以開始了。這包括分離在一系列連續的交疊克隆（acontig）中旁側標記之間的DNA。染色體步查的基本原理和步驟

第一步是用旁側標記的探針篩選基因組文庫。制備探針的方法依賴所用旁側標記的性質，如果旁側標記是常規的RFLPs，則用來檢測RFLPs的探針可以直接用于篩選文庫；如果用的是基于PCR的標記，制備探針的方法依賴所用標記的類型和被篩選的文庫類型。對于涉及到許多不連鎖DNA片段擴增的標記，應該只用相應的連鎖片段作探針。對于只擴增單個特定DNA片段的方法，如切割擴增多態性序列（cleavedamplifiedpolymerphicsequence,CAPS）標記，可以直接將引物用于基于網格狀YAC文庫的篩選。

染色體步查的基本原理和步驟

用每一個旁側探針第一次篩選通常產生一組（cluster）YACs。如果兩個旁側探針相距很近，且YAC文庫的插入片段很大，兩個探針可以雜交到同一個YAC上，說明這個YAC包括了目標基因。如果兩個YAC組不相連，就需要繼續步查。用探測到的YAC的外源DNA片段的兩端制作的探針可以作出更詳細的圖譜，這將確定YACs的末端關于同組其它YACs的圖譜定位。

染色體步查的基本原理和步驟

除了兩個末端外，所有末端都應該至少雜交到另一個YAC上，這兩個末端代表了這組YACs的最近端和最遠端（極末端）。以此極末端序列為探針，從分離群體中測定這兩個探針序列與目的基因的遺傳距離（交換率），選擇與目的基因距離較近的那個極末端探針，再開始第二步探測。重復這些步驟，直到探針序列與目的基因的遺傳距離為0或又變大為止。

染色體步查的基本原理和步驟

從第二步開始，也可以通過作限制酶切圖譜與前一片段比較來找出步查的方向。最后將目的基因定位到一個DNA片段上。必須注意的是，探針序列不能是重復序列。染色體步查的基本原理和步驟

由于YAC攜帶的外源DNA片段很大，尋找到含有目的基因的DNA片段后可以將其切割成更短的片段，用粘粒載體亞克隆后繼續細找。并通過功能互補法（或功能測定）找出確定的片段。

對于已建立了高密度遺傳標記的植物來說（如擬南芥菜），只需一兩步即能找到目標片段。當相關物種間有同線性存在時，一個物種中的標記也可用于另一個物種。目的基因的克隆Ⅳ

5定位克隆—染色體步查法轉座子標簽法的基本原理

首先將一對親本雜交，親本之一應含有活性的轉座子（自主轉座子），然后對子代中目的性狀發生的突變進行篩選，選擇比自發突變頻率高10-4～10-3范圍內的突變，這種突變很可能是由于轉座子插入了控制突變表型的基因造成的。用突變個體構建基因組