實驗九

噬菌體效價的測定目的要求1、掌握噬菌體效價測定的原理及方法2、觀察噬菌斑的形態實驗內容一

培養基和實驗物品的準備本次實驗準備工作（2人/組）1、配制牛肉膏蛋白胨液體培養液（pH7.4-7.6）；

（已準備好）。2、測定效價時稀釋用9ml牛肉膏蛋白胨液體培養液——3支/組，分裝于18×180mm試管；3、牛肉膏蛋白胨固體培養基（1.5%的瓊脂）——底層用，100ml/組，裝于250ml三角瓶，

（用于制備6個無菌平板，倒薄一點）4、上層用5ml牛肉膏蛋白胨半固體培養基（0.8%的瓊脂），融化后分裝于15×150mm試管中加塞包扎滅菌，6支/組；（教師已準備好）5、1ml無菌吸管5支/組。實驗內容二

噬菌體知識介紹一、幾個重要概念1、噬菌體：是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，分布極廣，個體很小，在光學顯微鏡下看不見，需用電鏡觀察。不同的噬菌體在電鏡下有三種形態：蝌蚪形、微球形和絲形。大多數噬菌體呈蝌蚪形，由頭部和尾部兩部分組成。2、噬菌斑：

在混濁的細菌菌面（菌苔）上形成的透明區域，是由噬菌體不斷侵染宿主細胞裂解形成的，其形狀、大小不等。3、噬菌體效價：

指1mL樣品中所含具有侵染活性的噬菌體（烈性噬菌體）數量——噬菌斑形成單位（pfu，plaque-formingunit）。效價（titre，titer）這一名詞在不同的場合有其不同的含義（如抗生素等）。二、病毒粒子的構造（模型）噬菌體的形態及分類科屬大腸桿菌T4噬菌體結構示意圖大腸桿菌T4噬菌體結構示意圖

及電鏡照片頭部六角形基板領環螺旋形尾鞘核心或管（中空）尾刺或刺突尾絲噬菌斑示意照片宿主細菌菌苔噬菌斑大腸桿菌T噬菌斑的表型形態三、噬菌體的分類

——根據噬菌體與宿主菌的相互關系烈性噬菌體（virulentphage）

能在宿主細胞內復制增殖，產生許多子代噬菌體，并最終裂解細菌。溫和噬菌體（temperatephage）

噬菌體基因與宿主染色體整合，不產生子代噬菌體，但噬菌體DNA能隨細菌DNA復制，并隨細菌的分裂而傳代，存在游離態、整合態、營養態三種形式。針對溫和噬菌體來說：前（原）噬菌體、溶源菌四、噬菌體繁殖（生活周期）1、吸附2、侵入3、增殖（生物合成）4、成熟裝配5、裂解釋放T4噬菌體吸附和DNA的注入T偶數噬菌體感染大腸桿菌

的掃描電鏡照片T4噬菌體的生活周期T4噬菌體的裝配五、噬菌體的應用1、細菌的鑒定與分型

噬菌體與宿主菌的關系具有高度特異性，即一種噬菌體只能裂解一種和它相應的細菌，故可用于未知細菌的鑒定和分型。2、遺傳學及分子生物學研究的重要工具

噬菌體基因數量少，結構比細菌和高等細胞簡單得多，且易獲得大量的突變體——構建基因文庫（λ噬菌體）；基因工程載體；噬菌體展示技術。3、細菌感染的診斷與治療

利用其專一性，可以診斷和治療一些相關細菌感染性疾病（用于治療時，其分泌的細菌素也可以應用，臨床外傷治療已有應用）但專一性也限制了噬菌體在臨床上的廣泛應用（人們最需要的是廣譜性）。六、噬菌體的危害在工業上會造成所培養菌體的大量裂解，使生產難以完成。表現形式：①發酵周期明顯延長；②碳源消耗緩慢；③發酵液變清，鏡檢時，有大量異常菌體出現；④發酵產物的形成緩慢或根本不形成；⑤用敏感菌作平板檢查時，出現大量噬菌斑；⑥用電子顯微鏡觀察時，可見到有無數噬菌體粒子存在。輕則延長發酵周期、影響產品的產量和質量，重則引起倒罐甚至使工廠被迫停產。七、以防為主的措施：1、決不使用可疑菌種；2、嚴格保持環境衛生；3、決不排放或隨便丟棄活菌液；4、注意通氣質量空氣過濾器要保證質量并經常進行嚴格滅菌，空氣壓縮機的取風口應設在30～40米高空；5、加強管道及發酵罐的滅菌；6、不斷篩選抗性菌種，并經常輪換生產菌種；7、嚴格執行會客制度。實驗內容三

噬菌體效價的測定一、噬菌體效價測定的方法

（梯度稀釋）斑點試驗法——涂菌平板上滴加稀釋液液體稀釋試管法——以不長菌判斷（澄清）雙層平板法——最常用，相對單層優點較多單層平板法載玻片法——快速其它病毒的效價（計數）測定——空斑計數、電子顯微鏡直接計數、免疫學間接測定（凝集、ELISA——酶標儀）——滴度表示噬菌體效價測定的方法二、雙層平板法二、雙層平板法37℃約4hr雙層平板法雙層平板法（1.5%瓊脂培養基~10mL）雙層平板法宿主菌懸液（對數期菌液0.9mL）噬菌體菌懸液（合適稀釋液0.1mL）上層培養基（0.8%瓊脂培養基~5mL）混勻計數單層與雙層平板法所形成的噬菌斑的比較雙層平板法的優點：①加了底層培養基后，可使原來底面不平的玻璃皿的缺陷得到了彌補；②所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上，因此不僅每一噬菌斑的大小接近、邊緣清晰，而且不致發生上下噬菌斑的重疊現象；③因上層培養基中瓊脂較稀，故形成的噬菌斑較大，更有利于計數。三、實驗原理一個噬菌體→侵染宿主細胞→引起裂解→擴散重復侵染裂解→形成一個噬菌斑（瓊脂凝膠中）宿主細胞數遠遠大于噬菌體數？噬菌體效價（pfu/ml）=噬菌斑數×10×稀釋倍數四、實驗步驟1、制備底層平板將已滅菌融化的牛肉膏蛋白胨固體培養基平板6個（倒薄一些），凝固。2、加入大腸桿菌敏感菌在每個牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上，無菌條件下，各皿加入敏感菌菌懸液0.9mL。3、稀釋噬菌體取1mL含噬菌體液加入到9mL牛肉膏蛋白胨培養液中，采用10倍稀釋法，分別制備噬菌體稀釋液（10-7、10-8、10-9）。4、噬菌體與大腸桿菌敏感菌混合將已加有大腸桿菌敏感菌6皿平板（10-7、10-8、10-9各2皿）中，分別加入0.1mL噬菌體稀釋液，混合后放置5分鐘。5、加入上層培養基將5mL溶化的半固體培養基中迅速倒入含噬菌體與大腸桿菌敏感菌平板中（45~50℃），并混合均勻。靜止凝固。6、培養37℃培養5小時或室溫培養12小時。7、觀察、計數觀察平板中的噬菌斑，將每一稀釋度的噬菌斑形成單位（pfu）記錄于表格內。8、計算噬菌體的效價按照六個計數原則選擇，計算每毫升未稀釋的原液的噬菌體效價。噬菌體效價（pfu/ml）=噬菌斑數×10×稀釋倍數實驗步驟框圖（教師進行演示操作）用牛肉膏蛋白胨固體培養基倒平板6皿（薄一點）

噬菌體稀釋液（10-7、10-8、10-9）0.1mL，各2皿敏感菌菌懸液0.9mL放入已有底層固體培養基的平板中混勻放置5分鐘將5mL溶化的半固體培養基中倒入上述平板中（45~50℃）混勻（動作？）37℃培養4小時或室溫培養12小時觀察結果計數①②③④⑤⑧⑦⑥教科書介紹方法的操作步驟噬菌體稀釋液0.1ml宿主培養液0.9ml45~48℃溶化好牛肉膏蛋白胨半固體培養基4ml混勻吸附5min搓動混勻后倒于有底層的平板中鋪平37℃培養5~6小時，觀察計數在無菌空試管中混勻上層后（3種成分），再倒入底層上鋪平。思考題噬菌體稀釋度10-710-810-9123平均123平均123平均pfu數/平板每毫升中的pfu數1、記錄結果，并進行統計分析。2、什么因素決定噬菌斑的大小？3、如果在你的測定平板上，偶爾出現其他細菌的菌落，是否影響你的噬菌體效價測定？4、噬菌體效價測定實驗中所用操作方法和書上介紹