《PrincpleandTechnologyofGeneticEngineering》

《基因工程原理》Professor,Dr.Degang

Zhao(趙德剛)GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,

CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity

E-mail:dgzhao@

1

第三章基因工程載體教學目的與要求：1）掌握基因工程常用載體特點2）掌握基因克隆的基本方法2

第一節載體的定義

3載體（Vector）是指在寄主細胞內能自我復制，并能夠作為運輸載體將重組DNA分子轉移到寄主細胞的DNA分子。（ADNAmoleculethatiscapableofreplicationinahostorganism,andcanactasacarriermoleculefortheconstructionofrecombinantDNA.）基因克隆載體：能承載外源DNA帶入受體細胞，并在其中自我復制以維持和擴增外源DNA的一類DNA分子，又稱為DNA克隆載體。基因表達載體Requireinavector:

CloningsitesOriginofreplicationSelectablemarkerSafety載體應該具備記到主要條件，以pBR322為例進行說明：1克隆位點:在DNA分子合適的位置有1到多個克隆位點，可供外源DNA片段插入克隆載體DNA分子中。2復制起點：具有復制起點，外源DNA插入載體后，仍可由復制起點起始復制過程。3篩選標記基因：具有用于選擇克隆子的標記基因。4安全性：克隆載體必須是安全的，不應含有對受體細胞有害的基因，且不能轉入除受體細胞以外的其他生物細胞，尤其是人的細胞。pBR322為例說明負篩選法：首先用不含AP和TC的培養基，兩種都長，然后選取一些菌落，在含AP的培養基上培養，不長的，說明有外源基因插入AP位點，到不含AP和TC的培養基的培養基上找到相應的點。第二節質粒載體（Plasmidvectors）

6一、質粒的定義質粒（Plasmid）:

一種存在于細菌、酵母等寄主細胞中染色體外的裸露雙鏈DNA分子（acircularDNAmolecules,foundinnature,inbacteriaandsomeyeasts.pDNA）。大小一般可從1千多個堿基到100多kb，多數在10kb左右?？截悢担阂粋€寄主細胞中某種質粒的數量與染色體數量之比。一般寄主細胞只有一套染色體。按照拷貝數的多少，可以將質粒劃分為嚴緊型質粒和松弛型質粒。當拷貝數在1-10之間時，通常稱為嚴緊型質粒。很多大質粒是嚴緊型質粒。當拷貝數多于10個時，通常稱為松弛型質粒，小質粒一般是松弛型質粒。嚴緊型質粒和松弛型質粒之間沒有嚴格界限。某種質粒對于某種寄主來說，拷貝數一般是一定的，拷貝數的存在是因為質粒上存在cop基因，它可以指令寄主細胞合成阻遏物，當質粒復制到一定拷貝數后，阻遏物也達到一定量，就阻遏質粒進一步復制。NumberofCopies：一個寄主細胞中某種質粒的數量與染色體數目的比值。Basedonthenumberofcopiesoftheplasmidfoundinthehostcell:lowcopynumberplasmids,stringent(嚴緊型)controlofDNAreplicationHighcopynumberplasmids,relaxedplasmid(松弛型)按照是否含有trans基因將質粒分為結合型質粒和非結合型質粒。Trans基因是一種可以指令寄主細胞產生鞭毛，合成細胞表面物質，促使寄主細胞與其他細胞相接合，導致遺傳物質從一個細胞轉移到另一個細胞。我們把含有trans基因的質粒稱為結合型質粒，把不含有trans基因的質粒稱為非結合型質粒。在基因工程中我們一般選用什么樣的質粒？松散型、非結合型

質粒的命名：p，plasmid表示質粒，隨后的兩三個大寫字母表示誰發現和發明了該質粒，數字表示質粒分離的次數或者構建的一系列質粒的編號。例：pBR322二、質粒克隆載體質粒經改造后即可成為基因工程載體。如前述pBR322，載體需有克隆位點和標記基因。標記基因種類很多：1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr，Tcr

，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:抗除草劑基因

2）營養標記基因（可直接用于選擇轉化子）。主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3）生化標記基因。其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ,GUS,CAT。葡萄糖苷酸酶基因（GUS）該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標記基因除具有上述lacZ基因的優點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。熒光素酶基因熒光素酶或由螢火蟲產生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產生熒光，若在反應中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發光細菌（Photobacterium

fischeri）產生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。發光蛋白質基因發光蛋白是由水母產生的一種可發光的蛋白質，該蛋白質可使大腸桿菌菌落呈藍色。

β—半乳糖苷酶基因（lacZ

和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標記基因。

β—半乳糖苷酶基因的優點:

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產物，檢測直觀

b.

lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大三、構建質?？寺≥d體的基本策略（Slightlymoreexoticplasmidvectors）1能在轉化的受體中進行有效復制、有較多拷貝數（松弛型的質粒ori）。2克隆位點：盡可能多一些，至少有一個。可用MCS連桿，MCS是指含多種內切酶識別序列的多克隆位點（multiplecloningsite），又稱多聚接頭（polylinker）。3篩選標記基因：選擇標記區內有合適的克隆位點，當外源DNA插入時，標記gene將失活而成為篩選的標識。4構建的質?？寺≥d體應盡可能小。大于15kb的plasmid轉化效率明顯。5根據需要，使構建的質?？寺≥d體組裝各種“元件”（小DNA片段）。如插入啟動子，終止子。Puc18/19克隆載體：1.2.68kb2.ori來源于松弛型質粒ColE1的復制起始位點，可在大腸桿菌E.ColiHB101,E.ColiC600等細胞中高效復制（DH5α）。3.含報告基因LacZ，lacZ取代了pBR332中的Tcr基因。

PLacZα

LacZβ

轉錄

翻譯

αβpUC18

BamHI片段重組DNA分子轉化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子pUC18/19中lacZ序列篩選：lacZ來源于乳糖操縱子，含有啟動子、調節因子和β-半乳糖苷酶的α-肽基因（lacZ）。該基因產物在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）培養基培養時，菌落是藍的。陽性克?。ㄞD化子）是白色的。pUC系列質粒載體由Messingetal.構建，具有三個顯著特點：1.分子量小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大2.易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因LacZα3.多克隆位點區

1)多克隆位點成對地存在于pUC18和pUC19中，位點排列順序相同，但方向相反,有利于外源DNA的克隆和定向插入

2)產生不同末端規律排列:兩端限制酶位點產生5’-突起端（EcoRI和HindⅢ),與之相鄰的兩個限制酶位點產生3’-突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI),中央四個限制酶位點產生5’-突起端或平端。這種排列方式十分有利于插入DNA片段的單向缺失和缺失片段的回收。pUCfamilyPolylinkerormultiplecloningsite[MCS]pUCm-T載體(pUCm-TVector):1線性化的載體，2載體每條鏈的3’端帶有一個突出的T。第三節大腸桿菌的噬菌體載體（BacteriophagevectorsforuseinE.Coli)一、噬菌體的定義（Whatarebacteriophages）噬菌體是吃細菌的病毒顆粒（viruses,“eaterofbacteria”）。CapsidtailGene3proteinCoatproteinDNAPhagesfallintothreemaingroups:

(1)tailless(2)headwithtail

(3)Filamentous（細絲狀）Geneticmaterial:(1)single-strandedRNA(2)double-strandedDNA病毒由DNA（orRNA）、外殼蛋白組成，經包裝后成為病毒顆粒。進入宿主細胞后，利用宿主細胞的合成系統進行DNA（orRNA）復制和殼蛋白的合成。DNA和RNA不能共存于同一種病毒中。噬菌體有嚴格的宿主專一性，限制了其作為載體使用的范圍。溫和噬菌體（Temperatephages

）：插入宿主染色體DNA→隨著宿主細胞的復制而復制→溶原階段（LysogenicCycle）烈性噬菌體（Virulentphages）：不插入宿主染色體DNA→自主復制→溶菌階段（LyticCycle）二、λ噬菌體載體（Vectorsbasedonbacteriophageλ）1.λDNA的特點1)λDNA：λ噬菌體中的DNA，線狀，48.5kb，編碼46個基因，集中于頭部。2)cos位點：左右兩端各12個核苷酸組成的5’-粘性末端。兩者核苷酸序列互補，λDNA在包裝前是線狀的，在包裝后是環狀的。3）46gene：成簇排列。不是所有gene都是生長必需的。

Capsidcomponents衣殼合成從A到J基因——左側區

Integration&excision分裂合成（陰影區為基因操作中非必需部位）

Early(late)regulation早、晚調節

DNAsynthesisDNA合成

Lysis

釋放4）有56種限制性核酸酶的酶切位點5）λ噬菌體的生長途徑有兩種。LysisofcellandreleaseofmaturephageparticlesInductionLysogenic

responeCelldivisionLytic

responepSuchasultravioletlightAssembledorpackaged5）λ噬菌體的生長途徑有兩種。λ噬菌體載體感染E.coli→λDNA注入細胞→（溶菌階段）→cos位點連接→復制→在R和S蛋白作用下細胞破裂λ噬菌體載體感染E.coli→λDNA注入細胞→（溶原階段）→在宿主細胞int基因作用下插入宿主染色體→復制紫外線2.λ噬菌體作為克隆載體的依據①λ噬菌體溫和噬菌體，感染性高，易操作。②λ噬菌體可承載大的外源DNA?？沙休d的外源DNA為λDNA的75%-105%（即38-51kb）且λDNA上有20kb的區域對λ噬菌體并非必需，可取代或缺失。3.λ噬菌體載體類型λ噬菌體載體有兩種類型，即插入型載體（Insertionvectors）和替換型載體（replacementvectorsorsubstitutionvector）。1.插入型載體（Insertionvectors）：多用于cDNA構建文庫。1）免疫功能失活型如λgt10，其左、右臂之間有一個CI基因，該基因應用了imm434免疫區段。該區段完全時，出現渾濁的噬菌斑——λ噬菌體進入溶菌階段；該區域被破壞時，CI基因失活，結果產生清晰的噬菌斑?？梢酝ㄟ^形態學上的差異將兩者分開。2)β-半乳糖苷酶失活型如Charon16A，λgt11。2.替換型載體（replacementvectorsorsubstitutionvector）常用于基因組文庫構建在左右臂之間有填充物，可以被外源DNA所取代，中央可取代片段兩側的多克隆位點是反向重復序列，因此當外源DNA插入時，一對克隆位點之間的DNA序列將被替換掉。Stuffers和polystuffer區可以被替換掉。EMBL4：當用兩端酶切位點時，中間也可以用其他酶切割一下，以防原噬菌體片段退火。Charon40：中間含有多節段區（polystuffer），MCS是反向重復序列。兩者可容納外源DNA能力9-22kb之間。

使用替換型載體克隆外源DNA包括三個步驟：①用恰當限制性酶消化λ載體，除去基因組中可替代的部分②將上述所得λDNA臂同外源DNA相連接③重組體的λDNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體圖3-8置換型載體組成示意圖圖3-9λEMBL3載體結構示意圖Phagemids(phasmids):thephagefunctionsareexpressed,forexample,λZAPfamilybystrategene.二、凱倫噬菌體載體凱倫噬菌體載體（Charonvector）是F.RBlattner在1977年在λ噬菌體基礎上發展出來的一種特殊噬菌體載體。Charon：是古希臘神話中一名老擺渡工，專門負責在斯蒂克斯河（Riverstyx）上，運送亡靈到陰間。

容納能力感染效率質粒：nkb-nbp

低，0.1%轉化率

λ噬菌體：大片段，nkb-23kb高幾乎每個顆粒都有100%感染率圖3-11λGEM-II載體結構示意圖三、M13噬菌體

M13噬菌體是一種絲狀（filamentous）噬菌體，內含有環狀、單鏈DNA分子（“+”鏈DNA）,長為6407個核苷酸，含DNA復制和噬菌體增殖所需的遺傳信息，可分為10個區。還有一個長507個核苷酸的基因間隔區（IS區），從第5489個核苷酸到第6005個核苷酸。M13的復制起點定位在基因間隔區內，但IS區內有些核苷酸序列即使發生突變、缺失或插入外源DNA，也不會影響M13DNA的復制，這為M13DNA構建克隆載體提供了條件?？删幋a三類蛋白質：復制蛋白質（基因Ⅱ，Ⅴ，Ⅹ）形態發生蛋白質（基因Ⅰ，Ⅳ，Ⅺ）結構蛋白質（基因Ⅲ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ）M13mp18M13噬菌體周期：①M13噬菌體通過鞭毛吸附，感染雄性大腸桿菌，M13噬菌體的“+”鏈進入細胞內，以此為模板，復制互補的“-”鏈DNA。由此產生的雙鏈M13DNA稱為復制型DNA（RF-DNA）。RF-DNA按一般環狀雙鏈DNA進行復制。②當細胞內RF-DNA達到近200個拷貝時，則RF-DNA中的“+”鏈DNA被單鏈特異的DNA結合蛋白結合，阻止“+”鏈DNA的復制合成。結果，細胞內只能以“-”鏈為模板不斷復制合成新的“+”鏈DNA。③新合成的“+”鏈DNA立即被積累在細胞內的殼蛋白包裝成新的噬菌體顆粒，并不斷擠出宿主細胞。（單鏈，“+”鏈→存在于噬菌體中，雙鏈DNA存在于宿主細胞中。）M13噬菌體周期的特點：①增殖過程不會導致宿主細胞的溶菌生長，被感染的細胞一個世代可以釋放1000個子代噬菌體。M13包裝DNA分子的能力可達M13DNA本身的6倍。②制備的M13DNA，單、雙鏈均可轉染大腸桿菌受體細胞，因此M13DNA作為載體時，不必進行體外包裝就可以直接轉染受體細胞。第四節原核生物應用的其他載體一、cosmid質粒載體①λ噬菌體特點：兩端部少于280bp，且含有cos位點，可以插入36.4-51kb長度的DNA；②質?？寺≥d體特點：不用包裝即可轉導?？寺∧芰σ话悴怀^10kb，載體大小一般也在10kb以下，是環狀雙鏈DNA.cosmid質粒載體特點：將λ噬菌體載體的cos位點和質粒克隆載體相結合，大約4-6kb長，能夠容納47kb的外源DNA。Cosmids:Thevector

bemadeupofplasmidsequencesjoinedtothecossitesofphageλ,about4-6kbinlength,canaccommodateclonedDNAfragmentsuptosome47kbinlength.二、噬菌粒載體M13噬菌粒載體（M13噬菌粒和質粒）優點是可以用來制備克隆基因的單鏈DNA。不足之處：A.插入外源片段后，遺傳穩定性下降，外源DNA越大越嚴重。B．外源片段只按一種方向插入；C．接受外源DNA能力有限，小于1500bp。噬菌粒載體特點：A.分子量一般都比M13載體小，約3000bp，易于操作；B.可得到10kb的外源DNA單鏈序列；？C.有質粒和噬菌體的復制起點，因此在大腸桿菌寄主中可以按正常雙鏈質粒DNA分子形式復制；在有輔助噬菌體時可以按M13形式復制；D.可以從噬菌體直接測序。例：pMB1replicon（復制子）:①體外包裝，感染，質粒型復制可容納外源DNA片段：30-45kb；②基因組文庫中使用。Genomemapping（酵母人工染色體亞克?。?。第五節真核細胞應用的載體

1Ti

質粒（Ti：Tumor-induce腫瘤誘發）根癌農桿菌(Agrobacterium

tumefaciens)與Ti質粒的G-菌，可侵入90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤(crowngalltumor)。冠癭瘤細胞具有以下特征：1）不需要補充植物激素便可進行離體培養；2）合成腫瘤特有的化合物—冠癭堿(opine)，能專一的為根癌農桿菌所利用。這兩個特征由Ti質粒決定，但該質粒中僅有一部分進入植物細胞。Ti質粒存在于根癌農桿菌中，大小為90-150x106道爾頓,結構是環狀雙鏈DNA,160-250kb，具六個功能區：①致瘤區：合成植物生長素和細胞分裂素；②冠癭堿（opine）合成區：參與冠癭堿合成；③冠癭堿分解區：參與冠癭堿分解；④Ti質粒轉移區(tra)：參與不同農桿菌中的接合轉移；⑤毒（性）區：參與T-DNA的轉移和插入植物染色體；⑥DNA復制區：參與Ti質粒DNA復制。Agrobacterium

oriOpinesynthesisT-DNALBRBCytokininsynthesisAuxinsynthesisVirulencegeneConstructionofTiplasmid合成氨基酸衍生物-冠癭堿Anxinsynthesisgene：合成細胞分裂素合成吲哚乙酸Cytokininsynthesisgene：Opinessynthesisgene：Ti質粒類型（由Ti質粒所產生的冠癭堿種類而定）有：①章魚堿類(octopine)；②胭脂堿類(nopaline)；③農堿類(agropine)T-DNA

：Ti質粒中與植物染色體結合的部位稱為T-DNA。T-DNA包括植物激素冠癭堿合成區基因及兩側相同的25bp重復序列，T-DNA整合不具特異性，右側25bp重復序列對T-DNA的轉移至關重要。2.Ti質粒載體的中間載體（intermediatevector）Ti質粒作為載體的問題：1）太大，不易轉化2）無適合克隆位點3）T-DNA致瘤區合成植物生長素和細胞分裂素，使轉化細胞成瘤狀，不能成為完整植株Ti質粒載體的中間載體由幾部分組成：A.適合E.Coli和A.Tumfaciens自主復制和選擇用標記基因B.適合于植物細胞選用的標記基因C.一段來自天然Ti質粒的部分T-DNA序列（提供同源重組）D．1-2個來自T-DNA邊界的25bp重復序列E．用于表達外源基因的DNA序列（如啟動子、終止子序列）Modified

TiplasmidDelete：

genesoftheproductionofbacterialfoodandofplanthormonesInsert：

selectablemarkergenepCAMBIA1301質粒T-Border(right)Nos3’Gus35S5’NcoI35S5’Hyg(R)T-Border(left)35S3’HinDIIISalIBamHIEcoRIBstEIIpCAMBIA130111837bpLacZ植物根部羥基乙酰丁香酮乙酰丁香酮植物細胞單鏈-DNAFormationofcrowngall

植物根部受傷部位分泌乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酸誘導Ti質粒vir基因及根瘤菌染色體上的一個操縱子表達vir基因產物將Ti質粒上T-DNA單鏈切下根瘤菌染色體上的操縱子表達產物與單鏈T-DNA形成復合物復合物轉化植物根部細胞

3．Ti質粒的轉移過程T-DNAIntegratingtoplantgenomeT-DNAIntegratingtoplantgenome

二、酵母應用的質粒載體以大腸桿菌質粒為基本骨架，具有酵母的DNA復制起始區，選擇標記，有絲分裂穩定區和外源DNA插入位點。Yeastepisomalplasmids（YEps

附加型質粒）：在pBR322中插入酵母篩選標記ura3和2μ質粒DNA片段（復制起始部位和rep基因），拷貝數高，穩定。以附加體形式在真核細胞中復制。（yeast2μplasmid,mayreplicateautonomouslyorintegrateintoachromosomallocation.）

Yeastintegrativeplasmids（YIps

綜合型整合質粒）：含有酵母的篩選標記ura3基因，但缺乏酵母的復制起始位點，所以，它只有整合到酵母染色體中才能復制。（YipsaredesignedtointegrateintothechromosomeinasimilarwaytotheYepplasmid.）

Yeastreplicativep