第四章糖代謝紊亂的生物化學檢驗檢驗醫學院臨床生化教研室

李伶2基本內容1.基本概念2.血糖測定的常規要求3.糖化蛋白的檢測4.胰腺分泌激素5.尿蛋白檢測臨床實驗室檢測血糖以及血糖調節物、糖化蛋白以及并發癥相關的其他代謝產物等，有利于糖尿病及其并發癥的早期診斷、鑒別診斷、指導治療和評估預后。1、標本推薦以血漿為標本分離血漿后盡快測定推薦測定靜脈血漿葡萄糖，采用葡萄糖氧化酶法或己糖激酶法測定葡萄糖表(Glucowatch)：此表比手表略大。每10分鐘自動顯示一次糖量,當糖過高或過低時會發出警告聲。此種結果雖不如靜脈血糖準確,反應也較血糖遲,但為自動連續測定,故發現低血糖或高血糖的機會比偶爾測定血糖要多。動態血糖監測儀每5分鐘提供一次血糖測量，并能最長能持續3天。也就是說，該系統能夠每天給出228個量血糖測量值，并最長能夠連續72小時提供總數為864個的血糖測量值。測量那些被指尖測量所忽略的血糖信息并能夠揭示出隱藏的血糖狀態，比如在某些時候出現的高或低血糖。

2.測定方法1896年Reid50ml血漿測定方法分類一、無機化學法——氧化還原法二、有機化學法——縮合法三、生物化學法——酶法四、儀器分析法——新技術和儀器分析法1）無機化學法（氧化還原法）

上世紀初建立的一類經典方法，基于葡萄糖在堿性環境下的烯二醇型結構具有很強的還原性班氏法（Benidict）第一個得到廣泛承認與臨床應用的方法[原理][評價]1.對標本中所有還原性物質均敏感2.結合酶法測定，用于鑒別Glu與其他3.新生兒尿糖測定：班氏法(+)酶法(-)提示新生兒遺傳性碳水化合物代謝病（乳糖、半乳糖、果糖、戊糖等）福林-吳法（Folin-Wu）又稱磷鉬酸顯色法[原理][評價]1.試劑便宜，來源廣泛，不需特殊儀器操作簡單，精密度基本能滿足臨床需要2.存在較大的非特異性干擾，使測定結果偏高干擾物如還原性谷胱甘肽、尿酸、肌酐、VitC、果糖、甘露糖、酮體、阿司匹林等還原性物質砷鉬酸法（Somogyi-Nelson）

原理類似Folin-Wu法僅將磷鉬酸換成砷鉬酸上述三種方法統稱氧化亞銅法堿性高鐵氰化物法[原理]

黃色無色

[評價]曾用于自動化分析，但特異性差。

肌酐、尿酸可使測定結果偏高2）有機化學法（縮合法）上世紀50年代起，利用葡萄糖在酸性環境下的醛型結構具有與多種芳香胺可進行縮合反應的特點進行測定的一類方法。多種芳香胺在酸性溶液中與葡萄糖的醛基縮合成葡萄糖胺，葡萄糖胺經脫水與分子重排生成藍色希夫氏堿(Schiffbase)芳香胺：苯胺、聯苯胺、對甲基苯甲酸、氨基羥苯等（致癌物）現選用：鄰甲苯胺（O-toluidine,O-T）鄰甲苯胺法（O-T法）[原理][評價]1.特異性較高：一般不與非糖物質發生反應，特異性優于福林-吳法，但可與己醛糖和戊糖反應2.線性范圍較寬：可達0~22.2mmol/L3.反應仍不夠特異；高濃度醋酸的使用和高溫煮沸的反應條件，對人與儀器均有害；另外，O-T有毒，尚被懷疑為致癌物質。O-T法是作為取代Folin-Wu法向酶法的過渡方法。3.生物化學法（酶法）全酶法與部分酶法（1）葡萄糖氧化酶法1.氧速率法（oxygen-rate）：GOD-OR法2.比色法（colorimetry）：偶聯酶催化顯色偶聯酶：過氧化物酶（peroxidase,POD）

過氧化氫酶，醛脫氫酶等顯色反應：GOD-POP法第二步稱Trinder反應

【方法學評價】適用血清/漿、腦脊液樣本，不適用于尿液及全血；第二步特異性較低；可檢測氧的消耗量。Trinder反應H2O2+4－氨基安替比林+酚POD醌亞胺+H2OPAP推薦方法[評價]該法準確度和精密度都能達到臨床要求，并且操作簡便，適用于常規檢驗，為我國血糖測定的推薦方法。（2）已糖激酶法

又稱HK法，該法分兩步完成，其測定原理如下：

【方法學評價】

該法準確度和精密度高，特異性高，常規抗凝劑和血清中的常見物質，如輕度溶血、脂血、黃疸、氟化鈉、肝素、EDTA和草酸鹽等都不會對本法產生干擾，適用于自動化分析。特異性高。

試劑昂貴，操作條件嚴格，為葡萄糖測定的參考方法。（3）葡萄糖氧化酶-極譜分析法該法是GOD-POP的改良方法，它以氧電極進極譜分析，直接測定葡萄糖氧化酶法第一步反應消耗的氧來進行定量，摒棄了特異性不高的第二步反應。（4）葡萄糖脫氫酶法

（GlucoseDehydrogenase,GD）[原理][評價]該法高度特異，不受各種抗凝劑和血漿中其他物質的干擾。制作成固相酶，可用于連續流動分析，也可用于離心沉淀物的分析。？？？本法高度特異，不受各種抗凝劑和血漿中其他物質的干擾。制成固相酶，可用于連續流動分析，也可用于離心沉淀物的分析。一、空腹血糖（fastingplasmaglucose，FPG檢測方法：指至少8h內不攝入含熱量食物后測定的血漿葡萄糖。

空腹血糖水平反映了胰島素分泌能力，其增高與葡萄糖耐量減低是相平行的空腹血糖水平是診斷糖尿病最主要的依據。。空腹血糖水平反映了胰島素分泌能力，其增高與葡萄糖耐量減低是相平行的空腹血糖水平是診斷糖尿病最主要的依據。2.應用的評價FPG是糖尿病的常用檢測項目，但在2型糖尿病中，高血糖是相對較晚才產生的，因此僅應用FPG這個標準將延誤診斷，并對糖尿病人群的流行估計過低。3.檢測方法的評價己糖激酶法、葡萄糖氧化酶法、葡萄糖脫氫酶法二、餐后2h血糖檢測方法監測餐后2小時血糖有兩種方法：一種是口服75克無水葡萄糖后做葡萄糖耐量試驗；另一種是吃100克面粉制成的饅頭或方便面(含糖量相當于75克無水葡萄糖，也叫饅頭餐試驗)。從吃第一口飯的時間開始計算，然后測量2小時后的血糖值。參考區間正常人餐后2h血糖＜7.8mmol/L。臨床意義餐后2h血糖是一個非常有價值的糖尿病病情監測指標：①反映胰島β細胞的儲備功能②若餐后2h血糖＞11.1mmol/L（200mg/dl），則易發生糖尿病眼、腎、神經等慢性并發癥③較好地反映進食量及使用的降糖藥是否合適餐后血糖升高是心血管疾病死亡的獨立危險因素三、葡萄糖耐量試驗檢測方法包括口服葡萄糖耐量實驗(oralglucosetolerancetest，OGTT)和靜脈葡萄糖耐量實驗（intravenousglucosetolerancetest，IGTT）。在口服或靜脈注射一定量葡萄糖后2h內做系列血糖測定，以評價個體的血糖調節能力的標準方法，對確定健康和疾病個體也有價值。常用的是OGTT。在口服一定量葡萄糖后2h內作系列血漿葡萄糖濃度測定，以評價不同個體對血糖的調節能力的一種標準方法。

OGTT在糖尿病的診斷上并非必需，因此不推薦臨床常規應用。OGTT標準方法試驗前3天，受試者每日食物中糖含量不低于150g，且維持正常活動，影響試驗的藥物應在3天前停用。試驗前應空腹10～16小時。坐位取血后5分鐘內飲入250ml含75g無水葡萄糖的糖水（妊娠婦女用量為100g；對于小孩，按1.75g/kg體重計算，總量不超過75g），之后，每隔30分鐘取血1次，共4次，歷時2小時。臨床意義（1）診斷妊娠糖尿病（GDM）（2）診斷糖耐量減退（IGT）（3）有無法解釋的腎病、神經病變或視網膜病變，其隨機血糖<7.8mmol/L，可用OGTT評價。在此時如有異常OGTT結果，不代表有肯定的因果關系，還應該排除其他疾病（4）人群篩查，以獲取流行病學數據評價OGTT在糖尿病的診斷中并非必需，因此不推薦臨床常規應用。雖然OGTT比FPG更靈敏，但它受多種因素影響且重復性差。（二）糖化蛋白的檢測糖尿病患者重要的常規檢查項目，主要用于血糖控制情況、病情及預后的評估。糖基化：通過非酶促反應將糖基加到蛋白質的氨基酸基團上。血糖測定只代表即刻的血糖水平，提示患者當時的身體狀況，糖化蛋白可提供較長時間段的血糖評估，是糖尿病患者疾病控制程度一項良好的指標。健康成人血紅蛋白的組成（四）糖化蛋白的檢測1、糖化血紅蛋白（HbA1C）糖化血紅蛋白是指血液中和葡萄糖結合了的那一部分血紅蛋白。血液中葡萄糖濃度糖化血紅蛋白糖化因紅蛋白水平反映的是在檢測前6-8周內的平均血糖水平，是判定糖尿病長期控制的良好指標。糖化血紅蛋白(HBA1C)正常4～6％

葡萄糖+血紅Pr→糖化血紅Pr,此反應不可逆,待RBC衰老死亡(180天)后分解

血糖增高→HBA1c增高,能反應過去6-8周血糖平均水平,是病情長期控制的有效判斷指標。（四）糖化蛋白的檢測（四）糖化蛋白的檢測糖化血紅蛋白的測定結果以百分率表示。HbA1c：非糖尿病患者：3-6%；糖尿病患者：＜8%，糖尿病的并發癥大大降低；

>9%，說明患者持續性高血糖，會發生糖尿病性腎病,動脈硬化,白內障等并發癥，并有可能出現酮癥酸中毒等急性合并癥。多種方法可用于GHb的測定：①根據電荷差異，可用離子交換層析，高效液相色譜，常規電泳和等電聚焦電泳等方法：②根據結構差異，可用親和層析和免疫測定法；③基于化學分析技術，可用比色法和分光光度法。不管什么方法，結果都表示為GHb占總Hb的百分比。臨床意義：反映過去6～8周的平均血糖濃度，可為評估血糖的控制情況提供可靠的實驗室指標。HbA1c為新的糖尿病診斷指標，診斷標準定為6.5％血糖控制指標（HbA1c＜7％）HbA1c為糖尿病患者心血管事件的獨立預測危險因素評價HbA1c檢測結果不受存在的變異型血紅蛋白及其衍生物的影響。GHb的形成與紅細胞的壽命有關，各種原因引起紅細胞壽命縮短時，GHb明顯減少；異常血紅蛋白病也會導致GHb改變。HbA1c的檢測方法已標準化、與糖尿病長期并發癥的相關性更強，生物變異性小檢測方法血液中的葡萄糖與血清蛋白的N末端發生非酶促的糖基化反應，形成高分子酮胺（ketoamine）化合物，其結構類似果糖胺(fructosamine)，總稱為糖化血清蛋白。由于90％以上糖化血清蛋白是糖化白蛋白（glycatedalbumin,GA，葡萄糖與血清白蛋白鏈內第189位賴氨酸結合），因此GA可以反映糖化血清蛋白的總體水平。五、糖化蛋白的檢測包括糖化血清蛋白與糖化白蛋白五、糖化白蛋白1.檢驗項目【項目檢測依據】血液中的葡萄糖與血清蛋白的末端發生非酶促糖基化反應，形成高分子酮胺化合物，其結構類似果糖胺，總稱為糖化血清蛋白。

90％以上糖化血清蛋白是糖化白蛋白（glycatedalbumin,GA），故GA可以反映糖化血清蛋白的總體水平。酮胺氧化酶法【檢測原理】【參考區間】10.8％～17.1％（中國血糖監測臨床應用指南2011年版）【方法學評價】本法簡便快捷、精密度高、準確性好、膽紅素對其干擾較小，可用于自動化生化分析儀。

2.檢測方法基于所帶電荷不同：陽離子交換層析法和電泳法基于糖化基團結構不同：親和層析法和免疫學方法化學分析技術：包括比色法和酶法常用的是硫代巴比土酸法和酮胺氧化酶法。【臨床意義】評價短期血糖控制情況；輔助鑒別應激性高血壓；篩查糖尿病：GA≥17.1％可以篩查出大部分未經診斷的糖尿病患者【應用評價】反映了2~3周血糖的平均水平，是一個短期血糖控制的評價指標。非酶促作用使葡萄糖與長壽命蛋白質（如膠原）或DNA相連，產生穩定的Amadori早期糖化產物。產物經一系列分子重排、脫氫和斷裂反應，產生不可逆的晚期糖化終末產物（advancedglycationendproduction,AGE）。AGE提供了一種比GHb更長期的糖尿病控制指標。

3、糖化終末產物AGE：【臨床意義】AGEs通過影響蛋白質和細胞外基質的功能，促進糖尿病的微血管和大血管病變，參與糖尿病慢性并發癥、動脈粥樣硬化、尿毒癥、阿爾茨海默病、白內障等多種疾病和衰老的發生、發展。【應用評價】比HbA1c更長期的糖尿病控制指標，監測長期血糖水平、評估糖尿病并發癥的程度。六、胰島素（insulin）及C肽（C-peptid）檢測方法胰島β細胞粗面內質網的核糖核蛋白體首先合成前胰島素原（preproinsulin），很快被酶切去信號肽后，生成胰島素原（proinsulin），貯存在高爾基體的分泌小泡內，最后被蛋白水解酶水解成活性胰島素（51個氨基酸殘基）和含31個氨基酸殘基的無活性的C肽（Cpeptide）。胰島素相對分子量為5.8KD，分泌入血后在體內的生物半壽期為5～10min，主要為肝臟攝取并降解，少量由腎小球濾過后在近曲小管重吸收和降解。C肽分子量為3.6KD，沒有生物活性，但對保證胰島素的正常結構卻是必須的。雖然胰島素和C肽等摩爾數分泌入血，但由于C肽的半壽期更長（約35min），因此在禁食后血漿C肽的濃度比胰島素高5～10倍。C肽主要在腎臟中降解，部分以原形從尿液排出。檢測方法利用胰島素和C肽的抗原性，采用免疫學方法進行檢測。目前有放射免疫分析法（RIA）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、化學發光免疫分析法（CLIA）、電化學發光免疫分析法（ECLIA）等。參考區間空腹胰島素（CLIA法）：4.0～15.6U/L。空腹胰島素（ECLIA法）：17.8～173.0pmol/L。C肽（ECLIA法）：250.0～600.0pmol/L。由于各廠商的產品不同以及各地區的差異，各實驗室應建立自己的參考值。臨床意義胰島素測定最主要的臨床用途是：對空腹低血糖患者進行評估。確認需進行胰島素治療的糖尿病患者，并將他們與靠飲食控制的糖尿病患者分開。預測2型糖尿病的發展并評估患者狀況，預測糖尿病易感性。通過測定血胰島素濃度和胰島素抗體來評估胰島素抵抗機制。臨床意義胰島素測定最主要的臨床用途是：對空腹低血糖患者進行評估。確認需進行胰島素治療的糖尿病患者，并將他們與靠飲食控制的糖尿病患者分開。預測2型糖尿病的發展并評估患者狀況，預測糖尿病易感性。通過測定血胰島素濃度和胰島素抗體來評估胰島素抵抗機制。葡萄糖刺激胰島素分泌的動態試驗有利于糖尿病類型鑒別C肽測定的主要用途：主要用于評估空腹低血糖評估胰島素的分泌監測胰腺手術效果評價測定C肽比測定胰島素有更多優點：①由于肝臟的代謝可以忽略，所以與外周血胰島素濃度相比，C肽濃度可更好地反映β細胞功能；②C肽不受外源性胰島素干擾且不與胰島素抗體反應。C肽主要通過腎臟排泄，腎病時，血中C肽濃度會升高，同時尿C肽濃度的個體差異大，限制了其作為評價胰島素分泌能力的價值。七、胰島素原（proinsulin）檢測方法是胰島素的前體和主要儲存形式，其生物活性僅為胰島素的10％。正常情況下僅少量的胰島素原（胰島素的3％）進入血循環。但肝臟清除它的能力僅為清除胰島素能力的25％，導致前者的半壽期比后者長2～3倍，約為30min，因此在禁食后血漿胰島素原濃度可達血漿胰島素濃度的10％～15％。利用胰島素原的抗原性，采用免疫學方法進行檢測。目前有放射免疫分析法（RIA）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、電化學發光免疫分析法（ECLIA）等多種方法。參考區間正常人空腹胰島素原參考范圍是1.11～6.9pmol/L（也有報道為2.1～12.6pmol/L）。各實驗室需建立自己的參考值。臨床意義胰島素原濃度增加見于：胰腺β細胞腫瘤。罕見的家族性高胰島素原血癥。存在可能與抗體起交叉反應的胰島素原樣物質。1型糖尿病2型糖尿病妊娠糖尿病評價胰島素原的檢測仍較困難，其原因是：血漿中胰島素原濃度低，難獲得純品，故抗體制備困難；不易獲得胰島素原參考品；多數抗血清與胰島素和C肽有交叉反應（兩者濃度都較高），同時胰島素原轉化中間體也會干擾檢測結果。八酮體的檢測乙酰乙酸、-羥丁酸和丙酮統稱為酮體。是游離脂肪酸在肝臟的氧化代謝產物。（二）酮體的檢測長鏈脂肪酸甘油三酯VLDL入血肝臟酯化轉化正常情況下：胰島素缺乏：酯化減弱，酯解增強長鏈脂肪酸氧化加強酮體肝臟（二）酮體的檢測乙酰乙酸、-羥丁酸和丙酮健康人-羥丁酸：乙酰乙酸1：1糖尿病人-羥丁酸：乙酰乙酸6：1酮體含有三種成分，檢測樣本可來自血液和尿液。尿酮的檢測多采用酮體檢查片法（Acetest）和尿酮體試紙條法（Ketostix）作半定量測定。β-羥丁酸的測定方法包括酸氧化比色法、氣相色譜法、酶法和毛細管電泳法。臨床常用的是酶法。酮體檢查片法（Acetest）、尿中酮體檢查劑法（Ketostix）和Gerhardt’s氯化鐵試驗均可用于體液酮體的測定,但均不能檢測酮體中的β-羥丁酸。參考區間以丙酮計，血漿酮體定量＜0.05mmol/L（20mg/L）。尿酮體定性為陰性，定量為20～50mg/d。健康成年人血清β-羥丁酸為0.03～0.3mmol/L。臨床意義在未控制的糖尿病中，血液乙酰乙酸堆積，其中大部分轉變為β-羥丁酸。尿酮體檢測已廣泛用于1型糖尿病的病情監測。（目前大多數尿液酮體試驗僅檢測乙酰乙酸，這將導致實驗檢測結果與病情不相符的情況出現。）尿酮體陽性還見于饑餓、高脂飲食、嘔吐、腹瀉、脫水、妊娠中毒血癥、甲狀腺中毒癥、消化吸收障礙等。評價測定血液和尿液中酮體的常用方法中，沒有一個方法能與乙酰乙酸、丙酮和β-羥丁酸同時起反應。丙酮和乙酰乙酸都有揮發性，且乙酰乙酸容易分解成丙酮，因此檢查時要盡量用新鮮尿(至少在排尿后兩小時內)以提高檢出率。緊張、劇烈運動、濃縮尿、低pH值、高色素尿或含有大量甲基多巴代謝物的尿液標本可以呈酮體假陽性反應。酶法測定β-羥丁酸靈敏度高、速度快、干擾小、適合自動化分析。乳酸通過細胞膜彌漫進入血液后，再入肝，在肝內異生為葡萄糖；葡萄糖釋入血液后，又被肌肉攝取，構成乳酸循環。九乳酸和丙酮酸的檢測血漿乳酸的正常值為1.0士0.5mmol／L＜2mmol／L均可視為正常一般認為乳酸濃度超過5mmol/L以及pH小于7.25時提示有明顯的乳酸中毒。（三）乳酸和丙酮酸的檢測丙酮酸是糖無氧代謝的產物，臨床上常和乳酸一同測定，并用二者的比值推測循環衰竭的嚴重程度，當機體處于無氧代謝狀態時，丙酮酸被還原為乳酸。測定丙酮酸濃度可用于評價先天代謝紊亂致血清乳酸濃度增加的患者。乳酸／丙酮酸正常應為9左右乳酸／丙酮酸，＜25糖異生缺陷乳酸／丙酮酸，≥35細胞內缺氧（三）乳酸和丙酮酸的檢測乳酸、丙酮酸的測定：乳酸：在340nm波長下測定NADH定量乳酸。該法特異性高，操作簡便，為乳酸測定的首選方法。丙酮酸：測定NADH吸光度的下降定量樣品中的丙酮酸。2、乳酸和丙酮酸的檢測乳酸是糖代謝的中間產物，其測定方法有化學氧化法、酶催化法、電化學法和酶電極感應器法丙酮酸測定方法包括2,4-二硝基苯肼法、乳酸脫氫酶法、高效液相色譜法等。參考區間不同標本乳酸參考值乳酸酸中毒出現于下列情況下發生：①A型（缺氧型）：常見，與組織氧合作用降低有關，如休克、低血容量和左心室衰竭；②B型：與某些疾病（如糖尿病、腫瘤、肝病）、藥物或毒物（如乙醇、甲醇、水楊酸）或先天代謝紊亂（如甲基丙二酸血癥，丙酮酸血癥和脂肪酸氧化缺陷