第九章放射性核酸探針的制備及應用探針（probe）是指經放射性等物質標記的特定的DNA或RNA序列。利用探針通過核酸雜交可檢測特定的基因或轉錄產物。在基因克隆、鑒定和分析的許多方面都涉及到利用探針進行雜交，例如，鑒定cDNA和基因組DNA文庫，需要用標記探針與菌落或噬菌斑雜交；分析目的基因的轉錄和加工情況需要用標記探針與RNA雜交，定位特定目的基因的位置，需要Southern雜交；構建限制酶圖譜也可利用雜交。總之，核酸雜交的使用范圍很廣。因雜交是在目的DNA與放射標記探針之間進行，故在進行利用雜交的分子克隆工作中經常需要制備各種核酸探針。核酸探針根據核酸的性質可分為DNA和RNA探針；根據用放射性標記物標記與否，可分放射性核酸探針和非放射性核酸探針；根據是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據放射性標記物摻入情況，可分為均勻標記和末端標記探針。一、雙鏈DNA探針

1、切口平移法(Nicktranslation)2、隨機引物合成法

二、單鏈DNA探針

1、從M13載體衍生序列合成DNA探針2、從RNA合成單鏈cDNA探針三、末端標記DNA探針

1、3，末端標記2、5，末端標記

(1)前向反應(Forwardreaction)

(2)交換反應(Exchangereaction)

四、寡按苷酸探針

1、T4多核苷酸激酶標記

2、末端轉移酶標記(Altar等，1989)

3、Klenow片段標記

五、RNA探針第一節放射性核酸探針的基本類型與制備方法第二節放射性核酸探針在分子生物學研究中的應用放射性核素（32P、3H、35S或125I）標記的核酸探針，已成為分子生物學研究的重要工具。它的利用，使得人們能夠從分子水平上直接進行遺傳物質的檢測（即基因的定位、定量和順序分析）以及重組DNA中目的片段的鑒定。這已成為同位素示蹤技術的一項新的內容。放射性核素探針與分子雜交技術相結合，可以用來鑒別重組子、分離基因、分析DNA片段、研究基因表達。本節主要介紹放射性核酸探針在分子生物學研究中的應用，同時介紹有關分子雜交的部分內容。一、分子雜交的基本原理互補的核苷酸序列通過Watson-Crick堿基配對而形成穩定的雙鏈分子的過程稱為雜交。形成雜交分子的前提是核酸單鏈之間具有一定的互補序列（即有某種同源性）。分子雜交是通過印跡將核酸分子固定在固體支持物上，然后用放射性標記或非放射性標記的探針與被固定的分子雜交，經顯影顯示出目的DNA或RNA分子所處位置。

二、Southern雜交MiddleSouthernblotting：1975年，E.M.Southern利用毛細作用將DNA轉移到硝酸纖維紙上，…….Northernblotting：1977年，Alwine利用毛細作用將RNA轉移到硝酸纖維紙上，…….Westernblotting：1979年，Towbin利用電場作用進行蛋白質轉移，…….Easternblotting：1982年，Reinhart利用電聚焦作用進行蛋白質轉移，…….三、放射性核酸探針在分子生物學研究中的應用（1）篩選載體外源DNA需要與某種工具重組，然后才能導入宿主細胞中進行克隆和保存或表達外源DNA中的遺傳信息，這種將外源DNA攜帶進入宿主細胞的工具稱為載體。根據核酸序列的同源性，利用放射性核酸探針與轉化后宿主細胞中的質粒或噬菌體進行雜交，可以篩選出重組的質粒或噬菌體。從而實現重組載體的篩選。（2）檢測基因表達細胞核內的DNA片段通過轉錄形成mRNA并釋放到細胞質中。被檢測基因在細胞中的轉錄情況可以進行如下分析：①Northern雜交檢查細胞中是否含有特定的mRNA，測定特定mRNA在總RNA中的比例，由此獲得目的mRNA的轉錄情況。②斑點雜交應特異性探針檢測mRNA，并估計表達過程中mRNA的轉錄程度。（3）篩選基因文庫由于在構建文庫的工作中需要篩選大量的重組子，通常都采用雜交進行篩選，以便在較短的時間內獲得陽性克隆。用DNA片段作為探針進行雜交的溶液主要有：甲酰胺；水溶液。這兩種溶液都能得到良好的結果。（4）鑒定作物品種由于不同品種的作物，其DNA和mRNA存在著差異，因此用特定的核酸探針進行不同品種間的分子雜交，可得到不同品種在遺傳物質上的差異。（5）診斷與鑒定病害在病害的診斷和鑒定中，核酸探針技術被認為是一種非常有力的手段。它不僅能確定染色體組的組成和基因的功能，而且為病毒的診