第五章蛋白質的結構與功能

第一節活性蛋白質與前體第二節血紅蛋白的結構與功能

第三節分子病第四節蛋白質分子進化第五節蛋白質變性第六節蛋白質與活性多肽的界限第一節活性蛋白質與前體

三、兩類前體的不同功能二、酶與酶原一、激素與激素原一、激素與激素原一、激素與激素原（二）腦啡肽與前體（一）胰島素與前體（一）胰島素與前體

胰島素原分子包含一條由81個氨基酸殘基組成的多肽鏈。鏈內有3對二硫鍵。其化學結構如圖5－l所示。

B鏈（l～30）在前、A鏈（61～81）在后，連接肽（C肽鏈）插在中間。即：H2N·B·C·A·COOH

在類胰蛋白酶及類羧肽酶B的催化下，從胰島素原分子上切下Arg31、Arg32、Lys59以及Arg60四個殘基，從而釋放出C肽，產生了有生物活性的胰島素（圖5－2）。

C肽在胰島素原分子中起何作用？有不同的意見。其中，一個比較合理的意見是：胰島素一條鏈的結構是生物合成的需要，有利于使胰島素的3對二硫鍵正確的配對。胰島素原還有的前體，即前胰島素原（preproinsulin）。通過一級結構測定查明，前胰島素原與胰島素原相比，在N端多出了一個肽段。此肽段稱為信號肽（signalpeptide）。人前胰島素原的信號肽其序列為：（二）腦啡肽與前體甲硫腦啡肽，其一級結構為Tyr·Gly·Gly·Phe·Met；亮腦啡肽，其一級結構為Tyr·Gly·Gly·Phe·Leu。腦啡肽結構與功能關系的一些規律1.Tyr1；以甲氧基取代酚羥基，則腦啡肽喪失鎮痛活性，其N末端延長一個Arg，則活性下降。2.Gly2：改為D－Ala，則鎮痛藥效大大提高。這可能有助于β－轉角的形成，與受體的結合，延長了半衰期。3.Gly3：為活性所必需，不能被取代。4.Phe4：可以被Trp、N－CH3·Phe取代，但不能被Tyr、Leu取代。5.Met5：去除，則活性下降，延長一個Thr，則活性不變。

二、酶與酶原表5－2酶原轉變成活性酶

二、酶與酶原（二）胰蛋白酶原的激活（一）胰凝乳蛋白酶原激活（一）胰凝乳蛋白酶原激活

由245個氨基酸殘基組成的，具有5對二硫鍵的一條多肽鏈，沒有酶活性。當胰凝乳蛋白酶原的Arg15與Ile16之間的肽鍵被胰蛋白酶切開之后，才具有酶活性。這種酶稱為π－胰凝乳蛋白酶。π－胰凝乳蛋白酶活性最高，但不穩定。

π－胰凝乳蛋白酶被其它π－胰凝乳蛋白分子作用（自身激活），切開Leul3－Ser14、Tyrl46－Thrl47以及Asnl48－Alal49間的肽鍵，釋放2個2肽（Ser14－Arg15；Thrl47－Asnl48），產生穩定的但活性較低的α－胰凝乳蛋白酶

胰凝乳蛋白酶原α－胰凝乳蛋白酶催化部位Aspl02、His57、Ser195具有相同的取向。

Arg15－Ile16之間的肽鍵被切開之后，形成了新的Ile16N末端。這個新末端的氨基與分子內部的Asp194的羧基能形成鹽鍵，從而使Ilel6的氨基質子化。這是使酶具有活性的重要條件之一。上述鹽鍵的形成，引起一系列的構象變化：構象變化從而形成了一個能與底物的非極性側鏈（芳香族氨基酸和Met的側鍵）相結合的疏水的“口袋”。“口袋”的一面由189～192殘基組成。這個結合部位（口袋）在酶原中是不存在的。它是結合底物的部位。酶分子中的Ser195和Glyl93的亞氨基能夠與底物中敏感肽鍵的羧基氧同時形成氫鍵Met192從酶分子的內部轉移到酶分子的表面；Gly187和Gly193更加伸展，構象變化（二）胰蛋白酶原的激活消化道中蛋白酶原激活的連鎖反應三、兩類前體的不同功能

現在看來，有兩類前體。一類是前胰島素原、前腦啡肽原、前甲狀旁腺素原等那樣的前體。其多肽鏈的N端區都有一個信號肽。表5－3列舉了各種蛋白質前體的信號肽。信號肽與蛋白質的分泌直接相關另一類前體，如胰島素原、腦啡肽原、各種蛋白酶的酶原以及血纖蛋白原、原膠原等，是調節生理功能，或者是形成特定構象所需要的。第二節血紅蛋白的結構與功能

六、影響血紅蛋白氧親和力的因素五、S形氧合曲線的生理意義四、血紅蛋白的變構效應三、血紅蛋白對氧分子的結合二、血紅蛋白分子結構一、概述

一、概述

血紅蛋白（hemoglobin，簡寫Hb）存在于人和脊椎動物的紅細胞中，是O2和CO2的運載工具。血紅蛋白是最早得到結晶的蛋白質之一，是第一個與生理功能相聯系的蛋白質，是第一個得到X射線衍射結構分析初步結果的蛋白質。從血紅蛋白一級結構的研究中提出了分子病的概念；從血紅蛋白與O2結合的研究中發現了協同效應。3種血紅蛋白的亞基組成如下：HbA：α2β2HbA2：α2δ2HbF：α2γ2

成人的血紅蛋白95％以上2％左右胎兒的血紅蛋白70～80％二、血紅蛋白分子結構

血紅蛋白是一種球狀的色素蛋白，分子量66，700，由珠蛋白和血紅素結合而成。（三）血紅素與珠蛋白結合（二）血紅素結構（一）血紅蛋白一、二、三、四級結構（一）血紅蛋白一、二、三、四級結構血紅蛋白（HbA）分子的α－亞基包含一條多肽鏈（稱α－鏈），由141個氨基酸殘基組成。β－亞基也包含一條多肽鏈（稱β－鏈），由146個氨基酸殘基組成。二者的一級結構如圖5－9所示。為了比較，抹香鯨肌紅蛋白的一級結構也列在圖5－9中。各肽鏈之間氨基酸的排列有許多相似之處。例如：在α－鏈和β－鍵一級結構上，有

60個位置的氨基酸殘基是相同的，占多肽鏈氨基酸殘基總數的42%左右，α－鏈、β－鏈與肌紅蛋白肽鏈(153AA)3者有23個位置的殘基是相同的血紅蛋白β－亞基三級結構血紅蛋白β－鏈肌紅蛋白構象比較血紅蛋白分子是四聚體，包含2個α－亞基和2個β－亞基。相同的亞基分別配對。4個亞基按四面體方式排布。亞基之間凹凸互補，形成1個長、寬、高分別為6.4、5.5nm、5nm的四面體圓柱形片段是α－螺旋區。血紅素以平盤表示。平盤中心的小球代表鐵原子血紅蛋白亞基之間的接觸8個鹽橋使脫氧血紅蛋白分子構象受到了約束，使其對氧分子的親和力低于單獨的α－或β－亞基對氧分子的親和力，低于氧合血紅蛋白的氧親和力此外，血紅蛋白的四級結構中，在4個亞基之間有一個中央空穴。2，3－二磷酸甘油酸（DPG）位于這一空穴中。DPG分子中幾個帶負電荷的基團與每個β－亞基的幾個帶正電荷的基團相互吸引，產生幾個鹽橋,使脫氧血紅蛋白分子的四級結構更加穩定，進一步降低了脫氧血紅蛋白分子對氧分子的親和力。

（二）血紅素結構

在血紅蛋白分子中每個亞基都包含1個血紅素（heme）。血紅素由1個鐵原子和1個原卟啉組成。原卟啉的結構4個吡咯環次甲基橋連接鐵原子的配位結合6個配位數（三）血紅素與珠蛋白結合血紅蛋白分子的每個亞基必須為血紅素提供一個疏水性的空穴，以利于O2

能與血紅素鐵原子結合。與血紅素結合的氨基酸殘基三、血紅蛋白對氧分子的結合

結合與解離，主要取決于氧分壓在血液中，血紅蛋白實際結合的氧分子數（或者已結合O2的氧結合部位數）對于血紅蛋白應該能結合的氧分子數（或者氧結合部位數）的百分比，稱為血紅蛋白氧飽和度，用Y表示。

血紅蛋白和肌紅蛋白的氧結合曲線四、血紅蛋白的變構效應

K1，K2，K3，K4分別為從上述各平衡公式可以得出：根據氧結合飽和度的定義，Y應該是：

當上述4個結合常數不相等時，也就是血紅蛋白分子中4個亞基的氧結合部位之間存在相互作用時，則Y對[X]（用氧分壓PO2表示）的關系表現為S形曲線但是，如果上述4個結合常數相等（k1=k2=k3=k4）時，也就是，血紅蛋白分子中4個氧結合部位之間不存在相互作用時，則Y對[X]的關系如（2）式所示：這是雙曲線。

因此，一般認為，在血紅蛋白分子中，α－亞基首先與O2結合：O2引起α－亞基構象變化。此構象變化使相鄰的β－亞基的構象亦發生變化，排除了β－亞基氧結合部位的空間位阻，從而提高了β－亞基對O2的親和力。這種作用，就是變構效應，或稱別構效應（allostericeffect）。許多蛋白質和酶都有變構效應。Adair模型、齊變（M.W.C.）模型和序變（K.N.F）模型

五、S形氧合曲線的生理意義肺氧分壓10.664～13.33kPa80～100mmHg肌肉氧分壓

2.666～5.332kPa20～40mmHg肌紅蛋白的雙曲線，可以設想：從肺[氧分壓在10.664～13.33kPa（80～100mmHg）]到肌肉[氧分壓在2.666～5.332kPa（20～40＝mmHg）]，氧分壓雖然有較大的變化，但是，Y值變化不大。即到達肌肉后，氧合血紅蛋白釋放的O2不多。這就遠遠滿足不了肌肉中生物氧化對于O2的大量需要。血紅蛋白是有變構效應的。S形曲線的上部較平坦。當氧分壓從13.33kPa（100mmHg）降到10.664kPa（80mmHg時（下降20mmHg），則氧結合飽和度（Y值）從0.95降到0.93（僅下降0.02）。這說明，在肺部，氧分壓雖有較大的變化，但血液的氧飽和度沒有多大改變。換句話說，存在較多的氧合血紅蛋白。在肺部，要求血液中所有的脫氧血紅蛋白盡量地結合更多的O2S形曲線的中段2.666～5.332kPa（20～40mmHg），坡度較大。當氧分壓從5.332kPa（40mmHg）降到2.666kPa（20mmHg）時，下降［2.666kPa（20mmHg）］，則Y值從0.6降到0.3（下降0.3）。變化較大。這說明，在肌肉中，氧分壓即使有很小的下降，血液中的氧飽和度亦有較大的下降。換句話說，在肌肉中，氧合血紅蛋白能釋放較多的O2。能滿足肌肉等組織的生理需要。六、影響血紅蛋白氧親和力的因素

氧親和力是指：血紅蛋白對于氧結合的牢固程度，表示為PO250。即血紅蛋白中的氧達到半飽和程度所需要的氧分壓（PO2）。（一）H+和CO2的影響

（二）DPG的影響

（一）H+和CO2的影響

波爾效應：H+濃度和CO2分壓的提高，能夠降低血紅蛋白分子對O2的親和力促使氧合血紅蛋白的氧解離曲線右移（右圖）

在肌肉中，高濃度的H+和CO2促使氧合血紅蛋白分子釋放O2。在肺中，高濃度的O2促使脫氧血紅蛋白分子釋放H+和CO2。問題一：提高H+濃度為什么能夠降低血紅蛋

白對O2的親和力？

實驗表明，在脫氧血紅蛋白分子中，H+的結合部位有：

α鏈N末端Val的－NH2基；β鏈His146的咪唑基；α鏈H122的咪唑基。

α鏈NA1Val的－NH2基與H+結合成帶正電荷的基團（－NH3+）。后者與另一個α鏈的C末端－COO－基形成鹽橋。

此外，H+還與β鏈His146的咪唑基結合成帶正電荷的基團。后者再與同一鏈上βAsp94的側鏈－COO－基生成鹽橋。這些鹽橋都有助于血紅蛋白脫氧構象的穩定。因而，增加H+濃度會降低血紅蛋白的氧親和力。問題二：提高CO2分壓為什么能夠降低血紅

蛋白對O2的親和力？

在脫氧血紅蛋白中，CO2的結合部位是4個亞基的N末端α－NH2基。CO2與N末端α－NH2基可發生下列可逆的反應：與氨基甲酸構成鹽橋的基團可能是：β82（EF6）Lys的ε－NH3+基；α141（H24）Arg的胍基。

波爾效應具有下列重要的生理意義：

當血液流經組織時，與血液相比，組織的pH值較低，CO2分壓較高，因而有利于氧合血紅蛋白分子釋放O2，使組織能比單純的氧分壓下降時獲得更多的O2。當血液流經肺部時，由于肺氣泡的O2分壓較高，促進脫氧血紅蛋白分子釋放ＣO2和H+。CO2的呼出，有利于氧合血紅蛋白的生成。（二）DPG的影響

DPG是紅細胞中大量存在的糖代謝的中間產物。它能夠降低血紅蛋白對O2的親和力，使血紅蛋白的氧合曲線右移（圖5－23）。

實驗表明，DPG與脫氧血紅蛋白的結合能力比氧合血紅蛋白高100倍以上。因此，DPG是與脫氧血紅蛋白結合的。

l個脫氧血紅蛋白分子能夠與一分子的DPG結合。

DPG分子與4個氧分子在脫氧血紅蛋白分子上的結合，是互相排斥的。

DPG降低血紅蛋白氧親和力具有下列重要的生理意義：

▼當血液流經O2分壓較低的組織時，紅細胞中的DPG能促進氧合血紅蛋白釋放更多的O2，以滿足組織對O2的需要。DPG的濃度越大，則O2的釋放量越多。紅細胞中DPG濃度的變化是調節血紅蛋白分子對O2親和力的重要因素。在空氣稀薄的高山上的人，或者換氣困難的肺氣腫病人，其紅細胞中的DPG代償性增加，使為數不多的氧合血紅蛋白分子盡量地釋放O2，以滿足組織對O2的需要。

第三節分子病一、概述二、鐮刀狀紅細胞貧血癥三、活性部位突變的血紅蛋白四、三級結構突變的血紅蛋白五、四級結構突變的血紅蛋白一、概述

分子病是一種遺傳性疾病。是指：由于DNA分子上的基因突變，而合成了失去正常生物活性的異常蛋白質，或者是缺失某種蛋白質，從而，影響了機體正常的生理功能而產生的疾病。基因突變包括下列幾種類型目前，發現的異常血紅蛋白，絕大多數屬于單個氨基酸取代，即單個堿基取代、例如：異常血紅蛋白S（HbS）和異常血紅蛋白C（HbC）都是由于血紅蛋白（HbA）β鏈上第6位的Glu發生了取代。在HbS中，變成Val；在HbC中，則變為Lys。單個堿基取代；一個或多個密碼子的嵌入或缺失；基因連接；終止密碼變異等。

按照分子遺傳學的三聯體密碼理論，單個氨基酸取代是由于遺傳密碼上的單個堿基取代而產生的。如下圖所示。

異常血紅蛋白，除了個別氨基酸殘基取代而外，還有一個或多個氨基酸殘基的缺失，肽段的相互融合，肽鏈延長，甚至于整個肽鏈的缺失等。▼改換分子表面。在血紅蛋白分子表面上的取代，絕大多數是無害的，但HbS等例外。▼改換活性部位。血紅素附近的結構發生變異，影響了血紅素對氧的結合。▼改換三級結構。氨基酸變異使多肽鏈不能折疊成正常的構象。這些異常血紅蛋白通常是不穩定的。▲改換四級結構。在亞基之間界面上的突變，引起變構效應的喪失。這些異常血紅蛋白通常具有異常的氧親和力。

異常血紅蛋白有下列幾種類型二、鐮刀狀紅細胞貧血癥遺傳性疾病，鐮刀形紅細胞血紅蛋白（HbS）比正常的紅細胞脆弱，易破碎，壽命較短

問題一：HbS與正常的血紅蛋白（HbA)在結構與性質上有哪些區別？

HbS比HbA多2～4個正電荷。HbS的等電點（6.91）比HbA的等電點（6.68）大0.23。在pH8.0緩沖系統中電泳，HbS的電泳速度較慢。脫氧HbS的溶解度很低，約為脫氧HbA的1／25。HbS的濃溶液，脫氧后會形成纖維狀沉淀。這個沉淀使紅細胞由扁圓形變成鐮刀形。

暴露于血紅蛋白（HbA）分子表面的是極性氨基酸殘基。在人類以及各種動物的血紅蛋白之間，分子表面的氨基酸殘基有明顯的差異。說明這部分的氨基酸容易變異，它們對于血紅蛋白的功能不是關鍵性的。已發現一百多種在分子表面發生氨基酸取代的異常血紅蛋白。這些取代，絕大多數不影響血紅變白分子的穩定性及功能。因此，在臨床上，它們是無害的。只有一小部分異常血紅蛋白可以引起臨床癥狀，例如：HbS、HbC、HbE、HbI以及HbKIbadan等。

問題二：HbS為什么能引起臨床癥狀？

在β鏈第6位，用Val取代Glu，就是把一個非極性殘基放在HbS分子的表面。這種改換明顯地減小了脫氧HbS的溶解度，但對氧合HbS的溶解度很少影響。這個事實對理解鐮刀狀紅細胞貧血癥的臨床癥狀是很關鍵的。

鐮刀形化的分子基礎可以設想如下：

1．用Val取代Glu，使HbS每個β亞基的外側產生了一個粘斑（圖5－26）。這個粘斑在脫氧和氧合HbS分子中都有，但HbA上沒有。

2．在脫氧HbS上有一個與粘斑互補的部位，脫氧HbS形成細長的聚合體，即一股螺旋纖維。3.幾股螺旋纖維纏繞在一起，就形成了在電鏡下可見的直徑為17nm和21.5nm的兩種纖維三、活性部位突變的血紅蛋白HbM發現于世界各地區和各種族。通過血紅蛋白的結構分析，發現其氨基酸取代有下列5種類型（表5－6）血紅蛋白M類型先天性青紫癥狀以及繼發性的紅細胞增多，稱為HbM病與血紅素結合的氨基酸殘基四、三級結構突變的血紅蛋白Pro是α－螺旋的破壞者。如果Pro取代螺旋段中的氨基酸殘基，則血紅蛋白分子構象便發生嚴重的擾亂，從而產生不穩定的血紅蛋白和CHBHA。有許多不穩定的血紅蛋白，就是由于Pro取代了螺旋段中的氨基酸殘基而產生的。例如：HbDuarte是β－鏈的螺旋段E6的Val62被Pro取代而產生的；HbGenoa是β－鏈的螺旋段B10的Leu28被Pro取代而產生的。β－鏈α－螺旋段B5缺失一個Val23β鏈非螺旋拐角區F7～FG2缺失了一個肽段[Leu（91）－His－Cys－Asp－Lys（95）]五、四級結構突變的血紅蛋白

在氧合血紅蛋白與脫氧血紅蛋白互相轉變時，血紅蛋白分子的四級結構發生了改變，在α1β2（或α2β1）的接觸處兩條肽鏈發生明顯的前后位移（圖5－20）。屬于這類血紅蛋白的有：HbYakima：β99（G1）Asp→His；HbKempsey：β99（G1）Asp→Asn；HbRadcliffe：β99（G1）Asp→Ala等。β102（G4）Asn如果發生取代，則破壞氧合狀態構象的穩定性，使血紅蛋白的氧親和力降低。例如HbKansas：βl02（G4）Asn→Thr。在亞基之間界面上的突變，引起血紅蛋白變構效應的喪失，出現異常的氧親和力。第四節蛋白質分子進化

一、概述二、細胞色素C分子的進化

（一）細胞色素c一級結構的種屬差異（二）細胞色素C三級結構的保守性

一、概述關于不同種屬生物的功能相同的蛋白質分子，其一級結構有種屬差異。蛋白質分子的三維結構，特別是關鍵部分，不能因為變異而受到嚴重影響。同源蛋白：指由共同的祖先分子經過變異和自然選擇而產生的功能上相同、相關或不同，但結構上有相似的不同蛋白質。3.在同源蛋白的進化過程中，氨基酸殘基之間的置換有下列規律：殘基側鏈的大小、形狀、柔性、電荷以及氫鍵形成能力等愈近似，則置換愈易發生，例如：Lys置換為Arg，Ile置換為Leu等。4.同源蛋白在進化過程中，其三維結構的關鍵部位是守恒的，尤其是活性部位（包括與金屬輔基或輔酶相結合的位置）的氨基酸殘基及其三維排布，均不會發生改變。5.蛋白質分子的疏水核，其疏水作用對維持蛋白質分子構象有重要的作用。6.蛋白質分子在進化過程中，某些功能能夠得到完善，或者新的功能能夠產生。7.同源蛋白的進化有兩個趨勢：一個是保全與完善其生物功能；另一個是產生新的生物功能，即功能異化。（一）細胞色素c一級結構的種屬差異

現在，已測出近百種生物的細胞色素C的一級結構。表5－7列舉了38種生物的細胞色素C一級結構。

脊椎動物的細胞色素C都是由104個（個別的103個）殘基組成的，但昆蟲的有108個殘基，植物的有111－114個殘基（一般為112個）。表5-8細胞色素C的種屬差異量

（以人為標準）細胞色素C的種屬差異量（A）及進化樹（B）（二）細胞色素C三級結構的保守性

圖5-32兩種不同種屬的細胞色素C三維結構的比較細胞色素C三級結構的保守性1.對于生物功能最重要的結構部位是最保守的。血紅素是細胞色素C分子的電子傳遞中心，在生物進化過程中保持不變。馬心細胞色素C分子構象Cys14、Cysl7

、His18

、Met80

、Tyr48、Trp59、6個殘基保持不變。乙烯基共價相連

Fe原子配位鍵相連丙酸基氫鍵相連2.不同物種的細胞色素C的狹縫區域，其疏水性殘基一般是守恒殘基，或者是可以保守性取代的殘基環繞狹縫周圍的是16個疏水性氨基酸殘基。l～47位氨基酸殘基分布于血紅素的一側48～91位氨基酸殘基分布于血紅素的另一側16個疏水性氨基酸殘基：6個Leu（32，35，64，68，94，98），3個Ile（81，85，95）；2個Pro（30，71），2個Phe（10，46），2個Tyr（48，67），l個Trp（59）。狹縫的結構嚴格地決定著整個細胞色素C分子的三維結構保守性取代所謂保守性取代是指：化學性質相似的氨基酸殘基之間有相互置換的現象。例如：Leu與lle，Val與Ile，Phe與Tyr，Asp與Glu之間都能互相替換。70～80肽段中的11個殘基都是守恒殘基。它們參與構成血紅素的疏水環境，對于細胞色素C的功能可能十分重要。3.多肽鏈方向發生改變的拐彎處，對于保持分子構象的形狀十分重要。

位于拐彎處的Pro（30，71，76）以及Gly（29，34，45，77，84）必然是守恒殘基。

血紅素與環境之間有兩個通道。血紅素與環境之間的兩個通道左通道是由52～74肽段盤繞而成的。通道中有3個疏水性的守恒殘基：Trp59、Tyr67、Tyr74。可能是電子傳遞通道右通道使血紅素的右側能與環境相通。是一個帶正電荷的區域4.在分子背部的上方，有一個帶負電的區域。在分子的右上方及左通道的口部，是一個帶正電荷的區域分子背部的上方的帶負電的區域包括2，4，61，62，66，69，90，93號殘基。它們都是可變的殘基。大多數都是帶負電的在進化過程中，該區域保持帶負電不變分子的右上方的帶正電荷區域由5，7，8，13，25，27，99，100等殘基圍成右通道，使血紅素的右側能與環境相通。允許種屬差異左通道的口部帶正電荷的區域

39，53，55，73，79，86，87。它們圍繞左通道的口部，成一環形，允許有種屬差異第五節蛋白質變性一、概述二、各種變性因素對蛋白質構象的影響三、變性蛋白質的構象四、變性和復性五、變性的預防和利用

一、概述（一）變性概念（三）變性現象（二）變性因素（四）蛋白質變性的鑒定方法（五）研究蛋白質變性的重要意義（一）變性概念由于外界因素的作用，使天然蛋白質分子的構象發生了異常變化，從而導致生物活性的喪失以及物理、化學性質的異常變化。變性可以涉及次級鍵、二硫鍵的斷裂，但不涉及一級結構上肽健的斷裂。（二）變性因素一類是化學因素酸、堿，有機溶劑（如：乙醇、甲醇、丙酮、乙醇等），尿素、鹽酸胍，表面活性劑（如：十二烷基硫酸鈉等），以及三氯乙酸、磷鎢酸、水楊酸等另一類是物理因素熱（60～70℃），紫外線、X射線、超聲波、高壓、表面張力以及劇烈的振蕩，研磨、攪拌等

（三）變性現象1.物理性質的改變

溶解度下降，有的甚至于凝集、沉淀；失去結晶的能力；出現流動雙折射現象；特性粘度增加；旋光值和橢圓度改變，以及紫外吸收光譜和熒光光譜發生變化等

酶水解增強

化學反應增多抗原性改變；生物功能喪失

3.生物性能的改變2.化學性質的改變（四）蛋白質變性的鑒定方法1.測定蛋白質的比活性2.以天然蛋白質作對照，測定蛋白質物理性質的變化。3.測定蛋白質化學性質的變化。4.用免疫法測定蛋白質的抗原性是否改變，抗體能否與抗原專一性結合。5.觀察蛋白質的溶解度是否下降，是否凝集、沉淀等。

（五）研究蛋白質變性的重要意義

1.大多數從事蛋白質和酶制劑研究的人，希望通過變性研究，認識并掌握變性條件、防止變性，以得到高活性的蛋白質和酶制劑。2.有些研究工作，需要利用變性條件。3.利用變性過程，研究維持蛋白質二、三、四級結構的作用力，研究各種作用力在決定活性部位上的作用。二、各種變性因素對蛋白質構象的影響（一）溫度的影響（二）酸、堿的影響（三）尿素和鹽酸胍的影響（四）表面活性劑的影響（五）有機溶劑的影響（六）鹽的影響（一）溫度的影響熱變性。熱變性有可逆和不可逆之分，一般來說，熱變性僅僅涉及次級鍵的變化。溫度升高使分子內的振動增強，從而破壞了維系空間結構的次級鍵，使蛋白質變性。

冷鈍化RNA酶在低pH范圍（1.13～3.15）內的可逆熱變性曲線△ε是相對天然蛋白的消光系數變化在低溫下，一些酶被冷鈍化。其中，有些酶的冷鈍化是不可逆的。但是，大多數酶的冷鈍化是可逆的。固氮酶的鐵蛋白，在0～1℃下放置

15小時，就喪失了固氮活性，在重新加溫到最適溫度時，不能恢復固氮活性。；丙酮酸核化酶在

0℃

放置一小時之后，幾乎完全喪失活性，然后，保溫

30分鐘，幾乎完全恢復活性。多亞基的蛋白質發生這類變化并不少見。煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白（鞘蛋白）亞基的聚合，隨溫度下降而降低。冷鈍化可能與酶的活性寡聚體解離成無活性的亞基有關。

（二）酸、堿的影響在多肽鏈的不同部位，存在著酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基。因而，在多肽鏈的不同部位的側鏈基團之間，存在著靜電的相互作用在許多情況下，酸、堿變性，是與埋藏在蛋白質分子內部的未電離的側鏈基團（主要是Tyr，His）有關的。當pH超過該基團的pK值幾個pH單位時，這些基團就發生電離，而帶上電荷。由于同性電荷相斥，使多肽鏈伸展，結果，這些基團便轉移到分子表面上。酸、堿所引起的蛋白質構象的變化，有大小之分。有的是很小的變化；有的則幾乎變成無規則卷曲；有的則是無序和有序兩部分同時并存的。（三）尿素和鹽酸胍的影響尿素（脲）和鹽酸胍是常用的蛋白質變性劑。下圖表示了β－乳球蛋白（β－lactoglobulin）的脲變性曲線。

β－乳球蛋白的脲變性曲線實驗條件：25℃，pH2.77，離子強度0.15，在365nm波長測定旋光率－[α]；在－[α]=－310℃時的平線相當于蛋白質完全伸展的構象

脲、胍使蛋白質肽鏈伸展而暴露出內部的巰基，巰基之間生成二硫橋，進而凝集和沉淀；脲、胍處理，使蛋白質形成穩定的鏈間非共價鍵，從而使蛋白質凝集或沉淀脲、胍與蛋白質生成氫鍵的能力比水分子強；它們可以通過破壞蛋白質分子內的氫鍵而使蛋白質變性脲、胍能增加非極性分子（包括非極性氨基酸）在水中的溶解度，從而將疏水效應減少1／3。這可能是脲，胍影響水結構性質的間接結果。由此推測，脲、胍很可能通過破壞蛋白質分子內部的疏水作用，從而使蛋白質分子伸展。此外，脲、胍也可能與蛋白質分子的折疊態和伸展態直接作用，產生各種效應。

（四）表面活性劑的影響長鏈的脂肪酸（如月桂酸）或相應的表面活性劑（SDS）很容易與蛋白質結合，使蛋白質變性。與脲、胍不同，這類變性劑不需要高濃度，在很低的濃度下，就能與蛋白質高度的結合。大多數蛋白質與

SDS結合的比例很相似，而且，結合的比例是溶液中自由

SDS平衡濃度的函數

各種蛋白質與SDS結合的比例是溶液中自由SDS平衡濃度的對數的函數十六烷基三甲基溴化物（cetyltrimethylammoniumbromide）是帶正電荷的；異辛烷基苯氧基多乙氧基－乙醇（isooctoylphenoxypolyethoxyethanol，又稱TritonX－100）是中性的。這兩種表面活性劑也用來解離蛋白質四級結構，或者，用來從生物膜中脫下膜蛋白．中性表面活性劑也經常用來對病毒進行溫和的破碎。（五）有機溶劑的影響對蛋白質來講，一般把非水溶劑分成兩大類：強質子性溶劑和弱質子性溶劑。強質子性溶劑主要是有機酸和有機堿。弱質子溶劑主要是一些醇和酰胺。一般認為，有機溶劑可以影響靜電力，氫鍵和疏水作用，從而導致蛋白質的構象變化，主要表現為螺旋度的增加。

（六）鹽的影響不同的鹽對蛋白質的構象有不同的影響。例如：對于RNA酶構象的穩定性，有些鹽（如：KSCN，CaCl2）有降低作用；有些鹽（如：（NH4）2SO4）有提高作用；有些鹽（如：NaCl、KCl）沒有作用（下圖）。各種鹽對RNA酶解鏈溫度（Tm）的影響所有的溶液含有：5mg／mlRNA酶，0.15mol／KCl；0.013mol／