紫外分光光度法

與

紫外分光光度計的選購主要內容紫外可見光譜法應用及其發展用好紫外可見分光光度計紫外可見光分光光度計的選購體會一、紫外可見光譜法應用及其發展UV-VIS波長范圍190-400nm紫外區400-750nm可見區750-1100nm近紅外區吸收光譜來源吸收光度法：當一束連續光源通過單色器，被分解為各個波長單色光，單色光通過樣品后被選擇性吸收，用光檢測器給予記錄不被吸收的透過光，形成的圖像就是吸收光譜選擇性吸收物質對光的吸收是選擇性的，利用被測物質對某波長的光的吸收來了解物質的特性，這就是光譜法的基礎。有機化合物的紫外—可見吸收光譜是三種電子躍遷的結果：σ電子、π電子、n電子。峰型及強度最大吸收波長峰寬強度吸收光譜強度I0＝Ｉa+It+IrT%（透射率）＝It/I0×100%A=-lgT定量基礎——比爾定律A（λ）＝-lgT=ε（λ）×L×C

ε：摩爾吸光系數，是物質對特定波長光吸收能力的量度，其物理意義是1mol單位濃度1cm單位光程時的吸光度。

L：光程

C：濃度成立條件： 單色光、澄清的稀溶液

K由于共軛性吸收帶，起因與多烯、烯酮等B由于苯（環）性，起因于芳香族、雜芳香族化合物，有時候尚能顯示精細結構R由于自由基性吸收、起因于CO、NO2等發色基團苯環、酰基……CCH3On→p*p

→p*紫外可見分光光度計的主要應用（1）定性分析（參加）（2）結構分析（參加）（3）純度檢查

例如：CCl4中有無CS2，只要看318nm處的吸收峰；乙醇中是否含苯，只要看256nm的強吸收峰（4）定量分析（Beer定律，主要應用）

例如：Cr6+測定；水中氨氮測定、土壤有效硼、維生素C……（5）動力學分析

例如：測定反應速度常數、測定催化效率、酶催化……UV-VIS的應用及其最新進展新發展之一——應用領域不斷擴大

藥品檢驗、醫療衛生、化學化工、環保、地質、冶金、石油、食品、生命科學、材料科學、計量科學等科研、教學及生產中，使用最多、覆蓋面最廣的分析儀器。新發展之二——許多分析方法衍生出專業的分析儀器：

水質COD分析，水質總氮分析，全自動生化分析儀，膜厚分析儀，白度分析儀器，快速成像儀，農殘快速分析儀、葉綠素分析儀、黑碳儀等等AethalometerTM

黑碳儀

新發展之三——新方法的應用

——化學計量學的發展（1）褶合光譜軟件包（ConvelutionSpectrum）第二軍醫大學吳玉田教授。可以對樣品不經過分離，直接應用紫外可見光度計分析含有6個不通組分的試樣，這一發明，對藥物分析工作來說，是一個重大突破，引起了國內外廣泛注意。（2）PE公司Quset軟件包，與Lambda9紫外可見分光光度計聯用，可直接分析10個組分。（3）高階張量數據解析復雜黑白灰體系分析湖南大學俞洳勤院士，。（4）PLS、因子分析、遺傳算法……（5）導數光譜的應用新發展之——多分析聯用技術生命物質等聯用技術，HPLCDNA/蛋白質分析流動注射分析FIA聯用積分光度法的復興——積分球應用、材料、太陽能譜、固體粉末表面性質研究，突破了以液體為分析對象的局限，極大的擴展了分析領域紫外可見分光光度計的組成（1）光源（2）單色器（3）吸收池（4）檢測器紫外可見分光光度計的分類1.單光束:一束單色光,一只比色皿,一只光電轉換器 優點:結構簡單,價格便宜 缺點:光度準確度等主要技術指標比較差,故分析誤差較大.(因雜散光,光源波動,電子學的噪聲等都不能抵消)

注:一般要求較高的制藥行業、檢驗行業、科研等行業不適宜。2.準雙光束:二束光，只有一只比色皿。其中，一束光通過比色皿，另一束光不通過比色皿（這束光主要起抵消光源波動對分析誤差影響的作用）

優點:結構較簡單,價格較便宜，光度準確度等指標較單光束儀器好。3.雙光束：二束光，二只比色皿，一只或二只光電轉換器（以一只光電轉換器常見）如1810D系列和19系列 優點:光度準確度等主要技術指標好,分析準確度高 缺點:結構復雜，價格較貴。——主流技術4.雙波長：采用兩個單色器 優點：主要適用于試樣的多組分測量。——已經很少見單光束雙光束近十年來，紫外/可見分光技術變化不大，始終沒有革命性的突破。然而，隨著光學設計、電子技術和軟件的進步，使得儀器的復雜性降低，可靠性和分析效能提高，這些都說明傳統儀器也在不斷發展。高性能新器件的發展，例如氙燈光源、CCD/PDA檢測器、光纖探頭附件儀器新進展

目前國際上的高檔紫外儀器：

PElamda900/950（S.L.7×10－7，N±0.00005A

（P-P））

熱電Evolution300（S.L.8×10－7，N±

0.0002A

（P-P））

VarianCary5000i（S.L.5×10－7，N±

0.0002A

（P-P））日立U-3200（S.L.5×10－6，N×）

U-3400（S.L.1×10，N×）島津UV-3101PC（S.L.1×10－6，N×）

UV-2401PC（S.L.1.5×10－4，N×）北京普析通用

TU-1901（S.L.1×10－4，N±00035A（P-P））國際高檔紫外可見分光光度計發展

向5個方向追求：

（1）更低的雜散光

（2）更小的儀器噪聲

（3）向小型化、專業化發展

（4）附件的開發與發展

（5）向短波、長波擴展175～3300nm（1）雜散光定義：單色器額定通帶以外的透射輻射能量與總的透射能量之比，也就是光譜通帶以外“不要的”光通量就是雜散光。測定方法：標準濾色片法

或NaI(220nm)、NaNO2(340nm)溶液。重要性：是分析誤差的主要來源之一，它直接限制了被分析測試樣品濃度的上限雜散光與吸光度相對誤差例：

如對某生物酶檢測：

它的吸光度為1.95Abs，要求1%誤差；如果儀器的S.L.=0.2%（0.002s），行不行？不行！因其誤差為3.6%！只有S.L.=0.05%（0.005s），才可達1%！雜散光的影響，會使分析測試的結果偏離比爾定律雜散光對測量線性的影響實驗技巧 因為雜散光強度在邊緣波段比較大，所以在波長小于220nm測試時，必須認真檢查有無“假峰”出現。定義：一種隨時間而變化、但又是隨機的輸出信號。測定方法：開機預熱、500nm處時間掃描120秒，測定P-P值，注意不是RMS值！主要來源：光學系統、光源、檢測器、電子元器件及電路設計等。重要性：是分析誤差的主要來源之一，它直接限制了被分析測試樣品濃度的下限。（2）噪聲噪聲與吸光度相對誤差和吸光度真值的關系例如，某紫外可見風光光度計的噪聲N=0.002A，在測試某樣品吸光度真值為0.1A。

則△A/A0=0.002/0.2×100%=2%

即由儀器噪聲引起的相對誤差則達到2%水平比較表廠商型號

PhotometricAccuracy(光度準確度)StrayLight（雜散光）PhotometricNoise（噪聲）Draft（基線漂移）BaselineFlatness（基線平直度）日本ShimadzuUV-310PC＋0.002A(0-0.5A)＋0.004A(0.5-1A)+0.3%T0.0001%(220nm)0.0001%(340nm)NotListed0.0004A/h2H后±0.001A(210-800nm)SBW2nm日本ShimadzuUV-2401PC+0.002A(0-0.5A)＋0.004A(0.5-1A)+0.3%T(0-100%T)0.015%(220nm)0.015%(340nm)NotListed0.0004A/h2H后±0.001ASBW2nm低速掃描中國普析通用TU－1901+0.002A（0-0.5A）＋0.004A(0.5-1.0A)+0.3%T(0-100%T)0.01%(220nm,340nm)+0.00035A500nm,0A,SBW2nm0.0004A/h2h后，500nm，SBW2nm±0.001A(200-850nm)SBW2nm0A中、慢速掃描技術指標比較表主要技術指標TU-1901中國普析通用Cary50美國VarianU-3010日本日立2401PC日本島津波長范圍190-900nm190-1100nm190-900nm190-900nm波長準確度+

0.3nm+0.5nm+0.3nm+0.3nm光譜帶度0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0nm1.5nm（固定）0.1,0.5,1,2,4,5nm0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0nm雜散光0.01%T(220nm)0.005%T(220nm)0.015%T(220nm)0.015%T（220nm）光度準確度+0.002A(0-0.5A)+0.004A(0.5-1A)+0.005A(1A處)+0.004A(1A處)+0.004A(1A處)光度噪聲+0.0004A（P-P值）500nm.0A0.0001A，RMS，500nm,0A0.0001A，RMS，500nm,0A未給出基線漂移0.0004A/h;500nm,0A,預熱2h0.0004A/h;500nm,預熱30分鐘0.0004A/h;340nm0.0004A/h;500nm,0A預熱2h基線平直度+0.001A;SBW2nm190-900nm+

0.001A200-850nm+

0.001A200-850nm+

0.001A200-850nm光檢測器光電倍增管（PMT）2個硅光電二極管光電倍增管（PMT）光電倍增管（PMT）（3）儀器向小型化、專業化發展由于環境、野外、海油等分析現場測試的需要，開發專業的便攜儀器成為一種趨勢。國際上已經有好多制造商正在研究開發適合于各種不同使用對象的小型儀器。美國OceanOpticPC2000卡式分光光度計；USB接口的USB2000微型光度計；

美國CID公司CI700；

普析通用公司PORS15；

美國HACH公司DR2400/DR2500

農殘速測儀器

PORS15水質分析儀USB2000SPAD-502葉綠素儀器農殘分析儀（4）附件的開發與發展附件的開發成為儀器發展的主要內容之一，附件的增加滿足了很多客戶特殊的測量要求。二、用好紫外可見分光光度計紫外方法分析應用中值得注意的幾個問題暗電流：直接造成光度準確度不好，測定誤差大。包括儀器的電路部分的固有的暗電流；由于光學系統密封不好以及樣品室密封不好進來的光照到接收器上產生的電流。校正條件：重裝軟件；電壓變化；環境發生變化；發現光度準確度有差異。2.重復性不好：首先要檢測儀器的穩定性和噪聲是否合格。如不合格，檢測電壓是否穩定、是否可靠接地；石英比色皿與玻璃比色皿混用。比色皿不干凈。比色皿制作質量揮發性強的有機溶劑要加蓋。溶液本身的問題。比色皿3、正確使用參比溶液與空白工作曲線中參比（空白）有好多種，如溶劑參比，試劑參比，樣品參比，褪色參比等等應根據不同的情況選擇不同的參比溶液。

（1）如果被測試液、顯色劑及所用的其它試劑均無顏色，可選用蒸餾水做參比溶液。

（2）如果顯色劑有顏色而被測試液和其它試劑無色時，可用不加被測試液的顯色劑溶液作參比溶液。

（3）如果顯色劑無顏色，而被測試液中存在其它有色離子，可用不加顯色劑的被測試液作參比溶液。

（4）如果顯色劑和被測試液均有顏色，可將一份試液加入適當的掩蔽劑，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑和其它試劑均按照操作手續加入，以此作為參比溶液，這樣可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。4、光譜帶寬的選擇

儀器分辨能力的指標，是分析誤差的主要來源之一

Owen提出：紫外可見分光光度計的光譜帶寬應該小于等于自然帶寬1/10時，分析準確度可達99.5%

儀器帶寬nm儀器帶寬/自然帶寬Aobs/A△A△A/A×100%0.40.020.99950.00040.0520.10.9950.00390.4650.250.9710.02452設自然帶寬為20nm，實測A=0.85Abs例：我國藥典規定對青霉素鈉測試使用1nm光譜帶寬。使用原則：在一定條件下，吸光度隨光譜帶寬變化，以獲得最大吸光度值的帶寬為準，同時考慮噪聲帶來的影響帶寬nm210.30.2吸光度Abs0.8050.8250.8650.823誤差%6.94.6

4.95、分析波長的選擇與動態范圍

1、波峰最靈敏、誤差較小

2、肩峰要求儀器波長準確度好

三、紫外可見光分光光度計選購體會國內外的生產廠家和主要產品歐美

PELambda750

，850，950等系列

熱電Evolution300/600

等系列

德國耶拿

SPECORD200

，SPEKOL1300

等系列

瓦里安

CARY50,CARY5000等系列

……日本

島津UV-1700，MultiSpec-1500UV-3150等系列

日立U-1800，U-2800，U-3310，U-4100

……國內普析通用1901系列1810系列T6系列

瑞利UV-2100

等系列

尤尼柯UV-3802

等系列

萊伯泰科

LabTechUV-1000/1100系列

上海精科UV762等系列

……Lambda950

六性：適用性可靠性智能性經濟性美學性工藝性李昌厚《紫外可見分光光度計》

化學工業出版社1、適用性：S.L.：濃度大的試樣（食品、農科等領域重要）N：生化、海洋等領域SBW：2nm（藥典）；固定、可調

2、可靠性：狹義——故障率、可靠性設計。廣義——光度準確度PA、故障、售后