抗體藥物活性評價的傳統方法和前沿技術,免疫學論文單克隆抗體作為治療藥物始于上世紀80年代初，因其具有高度的特異性、有效性和安全性的特點，在惡性腫瘤、本身免疫性疾病、感染和器官移植排擠等多種疾病中獲得了較好的治療效果，現已成為推動全球生物產業發展的引擎。截至2020年11月，已有50個抗體類藥物上市。2020年全球銷售排名前十位的處方藥中有6個為抗體類藥物，分別是Humira、Remicade、Mabthera、Enbrel、Avastin和Herceptin,單品種銷售額均超過50億美元[1].抗體藥物的接連上市和重磅銷售引發國內外抗體類生物治療藥物的研發熱潮。完善的質控標準是抗體類藥物批準上市的必要條件，面對抗體類藥物的快速發展，迫切需要建立相應的抗體藥物質量評價技術體系，而活性測定是對藥物的有效成分和含量以及藥物效價的測定，是確保抗體類藥物有效性的重要質控指標。抗體與其特異的靶點結合后，通過細胞因子信號的阻斷、補體系統的活化、細胞殺傷等生物學作用發揮重組抗體的治療作用，其生物學活性測定主要是在體外建立相應的細胞評價模型，模擬其作用機制，產生客觀的全程量效反響，并通過與活性標準品的比擬對其生物學活性進行評價[2].近年來，轉基因細胞技術和一些新技術也被應用于抗體類藥物的生物學活性測定。本文將對應用于抗體藥物活性評價的傳統方式方法和前沿技術進行扼要介紹，為新型抗體藥物活性方式方法的建立提供新的思路。1基于細胞的生物活性測定方式方法隨著藥物高通量挑選平臺的建立和生產規模的擴大，以及對3R〔Reduction,Refinement,Replacement〕原則理解的不斷深化，人們越來越多地尋求動物實驗替代方式方法。而基于細胞系的體外生物活性分析方式方法由于其高通量、高效率、高精到準確度等優勢，越來越遭到研究者和生產企業的青睞。單克隆抗體藥物的作用靶點分為細胞因子及其受體、腫瘤細胞外表抗原、CD分子、病原微生物及其產物、以及其他靶點，根據抗體藥物作用的特點，當前主要有下面幾類基于細胞的測活方式方法。1.1細胞增殖抑制法針對生長因子靶點的抗體藥物多是采用細胞增殖抑制的方式方法來反映抗體的生物學活性，包括抗血管內皮生長因子〔vascularendothelialgrowthfactor,VEGF〕單抗、抗人表皮生長因子受體2〔humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER2〕單抗及抗人表皮生長因子受體〔epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR或HER1〕單抗等。華而不實抗VEGF單抗的經典測活方式方法是人臍靜脈內皮細胞〔humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC〕增殖抑制法，即在刺激因子VEGF存在的情況下，抗VEGF單抗能夠以劑量依靠性的方式抑制HUVEC細胞的增殖。抗HER2單抗[3]的活性測定通常選取HER2陽性的乳腺癌細胞，如BT474、SK-BR-3、SKOV3等作為靶細胞，抗體與靶細胞外表HER2抗原結合后，能夠有效抑制細胞生長信號傳遞，進而抑制細胞增殖。抗EGFR靶點單抗[4]也是通過特異結合并封閉表皮生長因子受體，有效抑制腫瘤細胞生長，如DiFi細胞、A431細胞增殖抑制法等。1.2細胞毒性法細胞凋亡有兩條途徑，一是線粒體依靠途徑，另一個為死亡受體介導途徑。腫瘤壞死因子-〔tumornecrosisfactor-alpha,TNF-〕和受體結合后，可啟動死亡受體介導途徑，使procaspe-8自我水解、活化，構成活性caspase-8,后者再激活caspase3、6、7等，引起下面的級聯反響，導致細胞發生凋亡[5].重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白的活性測定能夠利用其能夠抑制TNF-所引起的敏感細胞系U-937中caspase3/7活化，通過Caspase-Glo3/7檢測試劑盒中螢光素酶發光信號的改變來反映該制品的活性。除此之外，針對TNF-的單抗還能夠采用對TNF-殺傷敏感的細胞系，如小鼠成纖維細胞L929、小鼠纖維肉瘤細胞WEHI164等，抗體能夠抑制TNF-所誘導的細胞凋亡作用，通過檢測細胞存活的染色來評價抗體的生物學活性。在細胞存活相關染料的選擇上，包括結晶紫、MTT、MTS、CCK-8等在內的染料具有各自的優缺點。結晶紫是一種三苯甲烷類染料，常用作生物染色劑和無機離子的顯色劑。其染色經過固然相對簡單，但是不能區分死活細胞，只能反映細胞數量。而MTT作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞復原成水不溶性的橙黃色甲臜產物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，因而可間接反映活細胞數量，但MTT復原產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。MTS復原產物是水溶性的甲臜，無需洗滌和溶解步驟，使用更方便，重復性優于MTT.而CCK-8溶液能夠直接參加到細胞樣品中，溶液相當穩定，對細胞沒有毒性，可長時間孵育，是用于測定細胞毒性或細胞增殖試驗中活細胞數目的一種簡便快速、靈敏度高、重復性好的染料。1.3補體依靠的細胞毒法〔complementdependentcytotoxicity,CDC〕單抗藥物與靶細胞外表分子結合后，可介導補體C1q結合到抗體的Fc段，并于腫瘤細胞膜上構成類似于穿孔素效應的攻膜復合體〔membraneattackcomplex,MAC〕,造成細胞外離子大量內流，最終導致腫瘤細胞的溶解。CDC生物學活性測定中一個的關鍵環節是補體的選擇及對其質量的控制，補體組分多，且熱不穩定，容易失活，當前所用的補體來源包括正常人血清、豚鼠、家兔等，來源復雜、劑型不同，因而在CDC實驗中需要考慮補體效力、穩定性，盡量減少活性測定反響終點和測定結果的變異。以CD〔clusterofdifferentiation〕分子為靶點的單抗藥物，如抗CD20單抗[6]、抗CD52單抗等，其生物學活性評價方式方法主要為CDC活性測定，即將重組抗體進行系列稀釋后與高表示出相應CD抗原的靶細胞結合，在補體存在的情況下，抗體與細胞外表抗原構成抗原抗體復合物，激活補體經典活化途徑，完成攻膜復合物的裝配并在細胞外表打孔，最終導致細胞溶解。利用上述檢測細胞存活的染料能夠對抗體的CDC作用效果進行評價。1.4抗體依靠性細胞介導的細胞毒性法〔antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC〕單抗藥物通過Fc段介導的免疫效應除了CDC作用外，另外一個重要的效應即是抗體依靠性細胞介導的細胞毒作用〔ADCC〕.傳統的ADCC檢測方式方法多為基于新鮮制備的外周血單個核細胞〔peripheralbloodmononuclearcell,PBMC〕或者自然殺傷細胞〔naturalkiller,NK〕作為效應細胞的殺傷試驗，以上方式方法存在細胞分離和培養困難、變異大、操作繁瑣、高背景值等缺陷[7].研究表示清楚，在NK細胞中Fc受體〔FcR〕活化，尤其是FcRIIIa受體〔CD16〕活化能夠引起NFAT〔nuclearfactorofactivatedT-cells〕信號通路的激活。近年來基于報告基因法已建立了穩定而可靠的抗CD20單抗的轉基因細胞ADCC評價方式方法。該方式方法以WIL2-S細胞系〔人B淋巴細胞〕作為靶細胞，使用工程改造的Jurkat細胞作為效應細胞，該細胞穩定表示出了FcRIIIa受體和由NFAT應答元件驅動表示出的熒光素酶報告基因。當高表示出CD20抗原的靶細胞與表示出FcRIIIa受體的Jurkat細胞通過抗CD20單抗橋聯時，可引起NFAT熒光素酶報告基因的活化，通過檢測熒光素酶化學發光信號來反映抗體的ADCC效應[8].該方式方法操作簡便易行，專屬性強、重復性好、準確性高，可作為抗CD20單抗ADCC生物學活性的常規檢查方式方法，用于評價包括人鼠嵌合單抗、人源化單抗、全人源單抗和糖基化改造單抗在內的各類抗CD20單抗的ADCC活性；更重要的是該方式方法可用于評價糖基化修飾與抗CD20單抗功能的關系，這也為該類制品工藝穩定性評價及構造與功能關系研究奠定基礎。1.5細胞ELISA法除了檢測抗體對細胞的增殖和毒性作用外，還能夠通過ELISA法[9]測定靶細胞與抗體及刺激因子共培養后分泌的細胞因子來評價抗體的生物學活性。例如抗IL-17單抗能夠根據其抑制IL-17誘導靶細胞釋放IL-6或GRO等細胞因子的能力來評價其生物學活性。將IL-17和IL-17單抗以及靶細胞接種到96孔板上，培養過夜。再通過ELISA法定量測定細胞上清液中分泌的細胞因子的含量，細胞因子的含量與抗體活性成反比。2轉基因細胞生物活性測定方式方法由于很多生物技術藥物沒有強反響性的細胞系，或者沒有易檢測的細胞學效應，構建轉基因細胞株成了很好的選擇。構建藥物反響性轉基因細胞株是根據藥物的作用機制來制定方案的。首先應該全面深切進入地研究藥物的作用機制，包括受體激活、信號轉導、信號傳遞以及終效應，選擇適宜的靶標作為藥物活性測定的指標。當前國內在建立轉基因細胞法測定生物治療藥物生物學活性領域已走在世界的前列。中國食品藥品檢定研究院通太多年的技術儲備，通過體外模擬創新藥作用的信號轉導機制，以導入藥物作用受體、報告基因或效應分子為策略，率先構建了簡便、快速、準確、非生物安全、動物替代的系列轉基因活性評價模型，華而不實干擾素測活的熒光素酶報告基因法，克制了國際通用的病毒抑制法中由操作活病毒導致的缺點，并使檢測周期縮短至原來的1/3[10];腦利鈉肽測活的第二信使cGMP競爭檢測法，與傳統的家兔主動脈條法相比，變異系數由66%降至13%[11];促紅細胞生成素的熒光素酶報告基因法無需復雜的動物實驗并可獲得與傳統體內紅細胞計數法高度一致的評價結果[12].系列研究成果實現了轉基因細胞理念用于解決一類新藥測活和傳統測活方式方法改良的突破，為保證用藥的安全性和時效性，提高檢驗質量提供了保障。當前國際上已有多個靶點的單克隆抗體藥物應用報告基因法進行生物學活性測定[13].例如，血管內皮生長因子抑制劑〔VEGFTrap〕的活性測定方式方法是在HEK293細胞中穩定轉染NFB熒光素酶報告基因質粒和2個嵌合受體基因。這2個嵌合受體是將VEGF受體1〔VEGFR1〕胞外區分別與IL-18受體〔IL-18R〕和IL-18受體〔IL-18R〕胞內區融合而成。VEGF與VEGFR1結合后發生二聚化，使得IL-18R和IL-18R胞內構造域互相作用，并傳遞信號，引起NFB熒光素酶報告基因活化；而VEGFTrap能夠抑制VEGF所引起NFB通路的激活[14-15].針對PD-1靶點的抗體是國內外新抗體研發的熱門，PD-1表示出于活化的T細胞，當與配體PD-L1和PD-L2結合后，可抑制T細胞的增殖以及相關細胞因子的產生[16].當前抗PD-1單抗大多采用競爭ELISA法來評價其結合活性，各研發單位也在積極探尋求索穩定而可靠的抗PD-1單抗細胞生物學活性評價新方式方法。例如利用穩定轉染NFAT報告基因/PD-1的Jurkat細胞作為效應細胞，高表示出PD-L1的CHO或HEK293轉基因細胞系作為靶細胞。通過微孔板包被的抗CD3抗體充分激活Jurkat后，將系列梯度稀釋的PD-1或PD-L1單抗與兩株細胞系經過一定時間的孵育后，通過熒光素酶檢測系統來評價抗PD-1或PD-L1單抗的生物學活性。除此之外另一個免疫調節類的熱門抗體是針對T細胞外表的細胞毒性T淋巴細胞抗原4〔CytotoxicT-LymphocyteAntigen4,CTLA4〕的抗體，它能夠阻止CTLA-4與其配體〔B7.1/CD80,B7.2/CD86〕結合，進而恢復CD28-B7共刺激信號通路的信號傳導[14].針對CTLA-4單抗的生物學活性測定能夠基于穩定轉染IL-2啟動子報告基因的Jurkat細胞，在DaudiB細胞和抗CD3抗體的共同刺激下，抗CTLA-4單抗能夠激活Jurkat細胞中IL-2信號通路，啟動熒光素酶表示出，通過熒光素酶檢測系統進行該抗體生物學活性評價。3基于新技術的生物學活性測定方式方法3.1外表等離子共振〔SurfacePlasmonResonance,SPR〕效價測定法外表等離子共振現象是發生在兩種折射率不同的介質界面上的一種光學現象，最早于1902年由Wood發現，并由Otto和Kretschmann等在1968年對其原理進行了詳盡的闡述。簡單而言，當光源的一束入射光從高折射率介質〔如玻璃〕射向低折射率介質〔如溶液〕的界面時，假如入射角大于一定的臨界角，入射光將會被100%地反射至光源的同一側，這叫做全內反射現象。當兩種介質之間有一層極薄的金屬膜〔最為常見的50nm金膜〕,這時入射光的能量將會引起金膜中等離子體的共振并以一種電磁場〔稱作消逝波〕的方式彌散至低折射率介質一側〔如溶液〕,進而導致反射光的能量在某個特定的角度降至最低〔圖1〕,這一角度被稱作SPRdip角。外表等離子共振作為一種生物傳感器技術廣泛地應用于分子互相作用分析領域，當分子間發生結合或者解離時，會定量改變金膜外表附近分子的濃度，進而導致金膜附近折射率的變化，進而導致SPRdip角的改變，通過實時監測SPRdip角度的變化，就能夠實時分析分子間的結合與解離經過。該技術無需預先標記熒光、二抗的分子，避免了標記基團對分子構象的影響，進而反映出分子間真實的結合性質；該技術樣品消耗量低，一般僅有微克級；除了獲取一般的親和力信息外，還能夠給出對闡述分子間結合機理更為難得珍貴的動力學信息。SPR技術已廣泛應用于小分子制藥和生物制藥領域[17-18],在抗體分析領域，其應用主要包括：〔1〕抗體候選物的挑選與評價，如從雜交瘤上清液中挑選出解離速率最慢的抗體分子；〔2〕抗體與抗原結合活性的分析，如人源化葉酸受體單抗與重組人葉酸受體的動力學與親和力[19];〔3〕抗體與受體結。合活性的分析，如抗體與FcRIIIa,FcRIIIb等受體結合的親和力、動力學信息；〔4〕抗體活性濃度分析，包括基于標準品的活性成分濃度分析和無需依靠標準品的活性成分濃度分析方式方法；〔5〕安全性評價中的免疫原性分析；〔6〕生物類似藥一致性分析。3.2均相時間分辨熒光〔HomogeneousTime-ResolvedFluorescence,HTRF〕均相時間分辨熒光是用來檢測純液相體系中待測物的一種常用方式方法，也是用來研究藥物靶標的理想平臺[20].該技術結合了熒光共振能量轉移〔FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET〕和時間分辨熒光〔Time-ResolvedFluorescence,TRF〕兩種技術。這種結合將FRET的均相實驗方式和TRF的低背景特點融合在一起，使得HTRF技術擁有操作簡單、靈敏度高、通量大、實驗數據穩定可靠、假陽性率較低的優勢。在HTRF實驗中，當供體和受體相離很近時，在供體和受體之間會有熒光共振能量轉移而產生信號。采用雙波長檢測能夠顯著減小緩沖液和培養基的干擾，最終的信號與產物構成的量成比例。HTRF技術進入藥物研發領域以來，加快了很多基于抗體的研究，HTRF技術可以以取代大部分ELISA,由于HTRF具有同等的檢測范圍和檢測極限，而且更節省實驗時間，并且不需要洗板的步驟，所以該技術近年來已被應用于抗體的活性檢測。例如，抗肝細胞生長因子〔hepatocytegrowthfactor,HGF〕單抗的結合活性測定就是一種競爭性抑制受體-配體結合的效價測定。通過鑭系元素螯合物均相時間分辨熒光法〔LANCEHTRF〕測定抗HGF單抗與HGF結合，并阻止HGF結合至其受體的能力。在測定中，將銪標記的HGF受體〔hu-HGFR-Eu〕結合至生物素標記的HGF〔biotin-huHGF〕,后者結合至鏈霉親和素-別藻藍蛋白〔SA-APC〕.該結合誘導銪和APC分子接近，而使熒光發生共振能量轉移，通過具有檢測HTRF功能的酶標儀進行檢測。抗HGF單抗能夠抑制biotin-huHGF結合至hu-HGFR-Eu,并阻止能量轉移，因而降低了熒光信號輸出，即抗體的量與產生的熒光量呈負相關。3.3Alpha技術〔AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay〕該技術既可用于檢測細胞內各個Biomarker,可以進行各類分子互相作用研究[21],簡單可靠。近年來，Alpha技術也應用于抗體的活性檢測，該技術主要含有兩種微珠，一種為供體，另一為受體。當供體微珠所帶有的抗原分子〔A〕與受體微珠所帶有的抗體分子〔B〕距離非常接近時，能夠使用680nm激發光去引發其外表所帶有的光敏感物質，使其催化周圍的氧分子構成活化態，產生效率可達每秒60000個氧分子活化態產生，借此將訊號放大，此活化態氧分子再與鄰近的受體微珠上的二甲基噻吩化合物產生化學冷光反響，產生冷光效應〔波長大約370nm〕,此冷光進一步借由能量轉換激發讓受體微珠產生520~620nm的發散光熒光信號，由于氧分子活化態非常不穩定，此反響相當快速僅4s,加上若此二種微珠距離超過200nm,反響隨之下降，所以只要抗原抗體分子結合才能觸發反響，通過測定熒光量來反映抗體的活性〔圖2〕3.4熒光染料標記法熒光染料標記法具有靈敏度高、選擇性高、方式方法簡便快速、樣品用量少等優點，已經廣泛地應用于生物、化學、醫藥、衛生、農業、環境保衛等領域中。應用在抗體活性檢測中，熒光染料能夠標記分子或細胞。〔1〕熒光染料標記細胞：熒光染料作為熒光檢測分析方式方法的載體，其性能的優劣直接決定了檢測方式方法的可行性及靈敏性。Calcein-AM〔鈣黃綠素-AM〕是一種可對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，Calcein-AM由于在Calcein〔鈣黃綠素〕的基礎上加強了疏水性，因而能夠輕易穿透活細胞膜。當其進入到細胞質后，酯酶會將其水解為Calcein〔鈣黃綠素〕留在細胞內，發出強綠色熒光。與其它同類試劑〔如BCECF-AM和Carboxy-fluoresceindiacetate〕相比，Calcein-AM是最合適作為熒光探針去標記活細胞的，由于它的細胞毒性很低。Calcein〔鈣黃綠素〕不會抑制任何的細胞功能，如增殖或趨化性等。〔2〕熒光染料標記分子：BODIPY〔氟化硼二吡咯〕類熒光染料作為一類新型的熒光染料，因其良好的光物理性質，在過去的二十年內得到廣泛的研究。與其它的熒光染料相比，BODIPY類熒光染料具有較窄的吸收和發射峰、較高的摩爾吸光系數、較高的光穩定性和化學穩定性以及較高的熒光量子產率等。例如，抗PCSK9單抗的的生物活性測定即是用BODIPY標記的低密度脂蛋白〔LDL〕通過HepG2細胞來測定其生物活性。PCSK9是前蛋白轉化酶枯草溶菌素9,能與低密度脂蛋白受體〔LDLR〕直接結合，促使LDLR內化和降解。降低肝細胞上LDLR的數量能夠降低肝臟從循環中去除LDL的能力。抗PCSK9抗體能夠與PCSK9結合，阻滯PCSK9與LDLR結合，增加LDLR數目，進而增加HepG2細胞中BODIPY標記的LDL熒光量。4生物學試驗的統計學分析在生物活性的定量測定中，一般有兩種反響類型，一種是直線性反響，另一種是曲線性反響。關于選擇何種擬合模型和統計學分析軟件更適宜的問題，主要從反響的實際曲線、擬合優度和簡便性三個方面考慮[22].目前美國藥典〔UnitedStatesPharmacopeia,USP〕、歐洲藥典〔EuropeanPharmacopeia,EP〕等比擬常用的統計學分析軟件包括UNISTAT、CombiStats、StatLIA、PLA、4-Parameter等。PLA2.0是一個不受硬件約束的，商業化的生物學分析軟件。它是Stegmannsystem的主要產品，當前有200余家公司在GMP環境下使用該軟件。該軟件基于歐洲藥典5.3版、美國藥典和其他科學出版物。StatLIAQuantum統計軟件在使用規模，數據儲存，可使用范圍，統計分析，人性化報告上具有很好的優勢，可用于活性檢測、定量檢驗、免疫原性質量挑選等方面。CombiStat軟件是由EDQM〔EuropeanDirectoratefortheQualityofMedicinesHealthCare〕研發，包括平行線分析、四參數和五參數、sloperatiomodel、probitmodel等，在歐洲應用廣泛。我們國家研發單位對于生物學活性的評價應用四參數〔4-Parameter〕模型擬合的較多，其數據呈典型的S型曲線，可反映出上下漸近線、EC50值和斜率等指標。USP、EP等國外藥典都強調生物統計在生物學試驗中的應用及其重要性，尤其是在數據類型和分析形式、數據采集、穩定性試驗和離散度的選擇方面對于生物學試驗的設計和發展至關重要。然而統計學分析手段在2018年版(中國藥典〕三部治療性生物制品活性測定中的應用是總體基本缺失的，這個問題在將來應充分重視。5結語分子生物學的快速發展和細胞信號通路的深切進入研究促進了基于細胞的生物活性測