第3章消毒滅菌與病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全主講人：《中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書》主編北華大學(xué)臨床微生物學(xué)教授海南醫(yī)學(xué)院特聘教授

李影林

2010年9月目的要求掌握：消毒、滅菌、抑菌、防腐、無(wú)菌的概念；巴氏消毒法的方法和溫度；高壓蒸氣滅菌的方法和溫度；紫外線滅菌的原理和特點(diǎn)；化學(xué)消毒劑的殺菌機(jī)制。熟悉：濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn)；真空干燥法保存菌種的方法；化學(xué)消毒劑的種類。病原微生物的分類；病原微生物實(shí)驗(yàn)室的分級(jí)；實(shí)驗(yàn)室感染的控制、監(jiān)督和法律責(zé)任。了解：干熱滅菌的方法；濾過(guò)除菌法的原理和方法；超聲波消毒法的原理；各種化學(xué)消毒劑的作用特點(diǎn)和適用范圍；影響消毒和滅菌效果的因素。第一節(jié)消毒滅菌的常用術(shù)語(yǔ)消毒（disinfection）滅菌（sterilization）防腐（Antisepsis）無(wú)菌（Asepsis）無(wú)菌操作(antiseptictechnique)消毒（disinfection）是指殺死物體上或環(huán)境中的病原微生物，但不一定能殺死含芽胞的細(xì)菌和非病原微生物的方法。用以消毒的藥品稱為消毒劑（disinfectant）。滅菌（sterilization）是指殺滅物體上所有微生物，包括病原微生物和非病原微生物、細(xì)菌的繁殖體和芽胞的一切方法。防腐（Antisepsis）是指防止或抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的方法，細(xì)菌一般不死亡。同一種化學(xué)藥品在高濃度時(shí)為消毒劑，低濃度時(shí)為防腐劑。無(wú)菌（Asepsis）不含活菌的意思。防止細(xì)菌進(jìn)入人體或其他物品的操作技術(shù)，稱為無(wú)菌操作。進(jìn)行微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、外科手術(shù)、醫(yī)療操作等過(guò)程，均需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作，以防止污染和感染。第二節(jié)消毒滅菌的方法物理消毒滅菌法化學(xué)消毒滅菌法化學(xué)消毒滅菌法是用化學(xué)藥品進(jìn)行消毒滅菌的方法熱力滅菌法輻射殺菌法濾過(guò)除菌法超聲波殺菌法干燥與低溫抑菌法熱力滅菌法

焚燒和燒灼：是一種徹底的滅菌方法。微生物實(shí)驗(yàn)時(shí)，接種環(huán)和試管口可通過(guò)火焰燒灼滅菌。干烤法：160～170℃，維持2～3h，可殺滅一切微生物包括芽胞。紅外線:波長(zhǎng)0.7～

1000μm的電磁波,其中以波長(zhǎng)1~10μm

者熱效應(yīng)最強(qiáng)。其熱效應(yīng)只能在照射到的表面產(chǎn)生。滅菌作用與干熱相似。干熱滅菌濕熱滅菌高壓蒸氣滅菌法(autoclaving)是一種最常用、最有效的滅菌方法。煮沸法：103.4kPa，100℃5min，殺死細(xì)菌繁殖體。流動(dòng)蒸氣消毒法（常壓蒸氣滅菌法）：蒸籠間歇滅菌法：反復(fù)多次的流動(dòng)蒸氣消毒法巴氏消毒法（pasteurization）一、物理消毒滅菌法在滅菌溫度和時(shí)間相同的情況下，以濕熱滅菌法效果為佳①濕熱條件下，菌體吸收水分，使菌體蛋白質(zhì)易于凝固變性。

②濕熱蒸氣的穿透力比干熱空氣強(qiáng)、故能較快提高滅菌物品內(nèi)部的溫度。

③熱蒸氣與被滅菌的物品表面接觸時(shí)氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)，放出大量潛熱，能迅速提高滅菌物品的溫度。高壓蒸氣滅菌法[高壓蒸氣滅菌器]

是一個(gè)密閉的蒸鍋，鍋內(nèi)蒸氣壓力愈大，溫度也隨之升高.滅菌效果最好、最徹底的滅菌方法[溫度和時(shí)間]1.05kg/cm2（103.43kPa）的蒸氣壓力→溫度達(dá)121.3℃，維持15～30min后，可殺滅一切細(xì)菌芽胞和微生物。[應(yīng)用范圍]

凡是耐高溫又不怕潮濕的物品，如敷料、手術(shù)衣、生理鹽水和一般培養(yǎng)基，均可用此法滅菌。61.1～62.8℃經(jīng)30min，或71.7℃經(jīng)15～30s（后一種方法多用）。巴氏消毒法[溫度和時(shí)間]

是用較低溫度殺滅液體中無(wú)芽胞的病原菌，但不影響消毒物品的營(yíng)養(yǎng)成分及香味的消毒方法。常用于不耐高溫的物品消毒，如牛奶、酒類等。[應(yīng)用范圍]輻射殺菌法日曬和紫外線[原理]

日光中殺菌的成分主要是紫外線。紫外線的波長(zhǎng)在200～300nm時(shí)，具有殺菌作用，其中以265～266nm殺菌力最強(qiáng)，易被DNA吸收。細(xì)菌DNA吸收紫外線后，其生物學(xué)活性發(fā)生改變，同時(shí)蛋白質(zhì)也光解變性，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

[特點(diǎn)]

紫外線穿透力弱，玻璃、塵埃、紙張、水蒸氣均能阻擋紫外線。[應(yīng)用范圍]

日曬是有效的殺菌方法，用于病人的衣服、被褥、書報(bào)等的滅菌。紫外線僅適用于手術(shù)室、嬰兒室、燒傷病房、傳染病房和無(wú)菌室的空氣消毒，亦可用于不耐熱物品的表面消毒。電磁輻射和微波原理：電離射線具有較高的能量和穿透力，對(duì)微生物有致死作用。包括高速電子、X射線和γ射線等機(jī)制：細(xì)胞分子產(chǎn)生誘發(fā)輻射，干擾DNA合成；破壞細(xì)胞膜，損傷酶系統(tǒng)；水分子電離后產(chǎn)生游離基和新分子如過(guò)氧化氫等殺菌。用途：電離輻射主要用于不耐熱的塑料、橡膠制品、藥品和食品的消毒與滅菌。微波：可穿透玻璃、陶瓷、薄塑料，不能穿過(guò)金屬表面。以熱效應(yīng)殺菌。用途：食品、藥杯等消毒濾過(guò)除菌法[應(yīng)用范圍]

濾菌器僅可除去細(xì)菌，不能除去病毒、支原體、衣原體等微生物。主要用于不耐高溫的血清、抗生素、藥液等物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)院的手術(shù)室、燒傷病房以及無(wú)菌制劑室，已逐步采用高效濾菌器。二、化學(xué)消毒滅菌法（一）殺菌機(jī)制1.菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，例如酚類（高濃度）、醇類、重金屬鹽類（高濃度）、酸堿類、醛類。2.干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)和代謝，例如某些氧化劑、重金屬鹽類（低濃度）與細(xì)菌的-SH基結(jié)合使有關(guān)酶失去活性。3.損傷菌細(xì)胞膜，例如酚類（低濃度），表面活性劑、脂溶劑等，能降低細(xì)菌細(xì)胞的表面張力并增加其通透性，胞外液體內(nèi)滲，致使細(xì)菌破裂。化學(xué)消毒劑按殺菌能力分為3大類。1.高效消毒劑——可殺死所有微生物

（1）含氯消毒劑

次氯酸鈉

常用種類二氯異氰酸尿酸鈉漂白粉作用機(jī)理：這類制劑遇水可產(chǎn)生氯（Cl2）、次氯酸（HClO）及新生態(tài)氧。氯可氧化細(xì)菌的-SH、次氯酸（HClO）可與胞質(zhì)成分作用，形成氮-氯復(fù)合物，干擾細(xì)胞代謝。特點(diǎn)：（1）具有強(qiáng)大的殺菌作用。（2）殺菌譜廣，作用快。（3）對(duì)金屬制品有腐蝕作用。用途：物品表面、飲用水、皮膚、地面、排泄物和污水等的消毒。

（二）分類（2）過(guò)氧化物消毒劑常用種類：過(guò)氧化氫、過(guò)氧乙酸、二氧化氯。

作用機(jī)理：主要靠其強(qiáng)大的氧化能力來(lái)滅菌?？墒辜?xì)菌酶蛋白中的-SH變?yōu)?S-S-，導(dǎo)致其酶活性的喪失。特點(diǎn)：①殺菌能力強(qiáng)。②其中過(guò)氧乙酸為強(qiáng)氧化劑，易溶于水，殺菌譜廣，無(wú)殘留毒性，但穩(wěn)定性差，并有刺激性和腐蝕性，不適合金屬器具消毒。③二氧化氯在水中溶解飽和后，即可以氣態(tài)向空中逸散，空氣中濃度達(dá)4mg/m3即可殺死99.99%的細(xì)菌、病毒、真菌，是當(dāng)前新型的安全無(wú)毒、廣譜高效空氣消毒凈化劑！用途：①3%~6%H2O2可殺死大多數(shù)細(xì)菌，10%~25%H2O2可殺死所有微生物（包括細(xì)菌的繁殖體和芽胞）。H2O2熏蒸可用于空氣消毒。H2O2蒸氣的等離子無(wú)菌技術(shù)可替代環(huán)氧乙烷對(duì)醫(yī)療器械滅菌。②過(guò)氧乙酸用于物品表面和皮膚消毒。（3）醛類消毒劑常用種類：戊二醛、甲醛。作用機(jī)理：對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)和核酸的烷化作用。特點(diǎn)：①具有廣譜、高效、快速的殺菌作用。②2%堿性戊二醛對(duì)橡膠、塑料、金屬器械等無(wú)腐蝕作用。③對(duì)皮膚黏膜有刺激性。用途：①適用于精密儀器、內(nèi)窺鏡的消毒。②甲醛對(duì)人有潛在的毒性作用，使用有限。主要用于HEPA濾器的消毒。（4）環(huán)氧乙烷作用機(jī)理：對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)和核酸的烷化作用。特點(diǎn)：①為雜環(huán)類化合物，沸點(diǎn)10.8℃，易蒸發(fā)。氣體消毒劑。②有穿透力，殺菌廣譜高效，殺滅芽胞能力強(qiáng)。③對(duì)多數(shù)物品無(wú)損害作用。④易燃，對(duì)人有一定毒性?？諝庵袧舛炔坏贸^(guò)1ppm。用途：現(xiàn)已有特制的環(huán)氧乙烷滅菌箱。使用安全方便。2.中效消毒劑—能殺滅微生物的繁殖體，結(jié)核分枝桿菌、某些真菌和有包膜的病毒，不能殺死芽胞（1）含碘消毒劑常用種類：碘酊（碘的乙醇溶液）、碘伏（碘與載體的結(jié)合物）。作用機(jī)理：主要依靠其沉淀蛋白和強(qiáng)大的氧化能力。特點(diǎn)：①可殺死細(xì)菌的繁殖體，不能殺死芽胞。②對(duì)皮膚有一定的刺激性，消毒后用75%酒精擦凈。用途：多用于皮膚黏膜、體溫計(jì)及其他物品表面的消毒。（2）醇類消毒劑常用種類：乙醇、異丙醇。作用機(jī)理：去除細(xì)菌包膜中的脂類，使菌體蛋白變性。特點(diǎn)：①70%～75%乙醇?xì)⒕芰ψ顝?qiáng)。②異丙醇的殺菌作用比乙醇強(qiáng)，且揮發(fā)性低。但毒性較高。用途：多用于醫(yī)療器材、皮膚的消毒、浸泡體溫計(jì)。3.低效消毒劑—可殺滅多數(shù)細(xì)菌繁殖體，但不能殺死芽胞、結(jié)核分枝桿菌及某些抵抗力強(qiáng)的真菌和病毒（1）季銨鹽類消毒劑常用種類：溴銨（商品名為新潔爾滅）作用機(jī)理：為陽(yáng)離子表面活性劑，可吸附細(xì)菌的表面，改變胞壁通透性，使菌體內(nèi)的酶、輔酶、代謝中間產(chǎn)物逸出，呈現(xiàn)殺菌作用。特點(diǎn)：①無(wú)色無(wú)味、刺激性輕微。②易溶于水，可減低液體表面張力，使物品表面油脂乳化，易于除去，具有清潔作用。③因細(xì)菌帶陰電荷，故陽(yáng)離子表面活性劑殺菌作用較強(qiáng)，但不得和陰離子表面活性劑合用。用途：可用于皮膚黏膜、物品表面、地面的消毒。2.氯己定常用種類：商品名為洗必泰。特點(diǎn)：（1）為雙胍類化合物，無(wú)色無(wú)臭，刺激性輕微。（2）不得和陰離子表面活性劑合用。用途：可用于皮膚黏膜、物品表面、地面的消毒。3.高錳酸鉀特點(diǎn)：具有氧化殺菌作用。用途：可用于皮膚黏膜沖洗、浸泡消毒及食（飲）具、蔬菜、水果的消毒。第三節(jié)消毒滅菌的運(yùn)用一、醫(yī)療器械物品的消毒滅菌（一）高危器械物品進(jìn)入無(wú)菌組織的物品高壓蒸氣滅菌耐受熱力滅菌的物品高效消毒劑（環(huán)氧乙烷、戊二醛）耐受熱力滅菌的物品（二）中危器械物品不進(jìn)入無(wú)菌組織，但須接觸黏膜的物品流通蒸汽、煮沸、高壓蒸氣滅菌過(guò)氧乙酸、醇類、戊二醛浸泡浸泡前必須徹底洗凈，防超敏反應(yīng)。（三）低危器械物品只接觸未損傷的皮膚，不進(jìn)入無(wú)菌組織，不接觸黏膜（四）快速周轉(zhuǎn)的醫(yī)療器械消毒滅菌時(shí)間短又不損傷器材，難度較大纖維內(nèi)窺鏡、牙鉆、牙科手術(shù)器械常用瞬時(shí)滅菌、微波滅菌、高效消毒劑中效消毒劑/低效消毒劑+低熱（60℃）協(xié)同法二、室內(nèi)空氣消毒法（一）物理消毒法1.紫外線1.5w/m31h

最常用2.濾過(guò)除菌孔徑＜0.2μm（二）化學(xué)消毒法1.過(guò)氧乙酸噴霧0.5%水溶液30ml/m32.熏蒸3.二氧化氯溶液4mg/m34.中草藥三、手和皮膚的消毒（一）肥皂和流動(dòng)水經(jīng)常正確洗手是預(yù)防多種病原微生物感染的有效方法。（二）被病原微生物污染時(shí)

1.75%酒精

2.氯己定溶液

3.過(guò)氧乙酸

4.次氯酸鈉溶液

5.碘伏四、黏膜的消毒（一）口腔黏膜3%H2O2（二）沖洗尿道、陰道、膀胱0.1%~0.5%氯己定溶液；1g/L高錳酸鉀溶液五、病人排泄物與分泌物的消毒滅菌（一）多用含50g/L次氯酸鈉、漂白粉1h（二）等量200g/L漂白粉攪拌均勻2h六、病人污染物品的消毒（一）日常生活小用具1.煮沸15~30min/流通蒸汽30min；2.0.5%過(guò)氧乙酸浸泡、擦洗、噴灑。（二）污染的食品、果品禁止再食用，用200g/L漂白粉乳劑處理2h；煮沸30min；焚燒。（三）衣服、被褥用流通蒸汽消毒30min；含5%有效氯的消毒液30min

；15%過(guò)氧乙酸1g/m3熏蒸1h。（四）運(yùn)輸工具用5%過(guò)氧乙酸擦洗、噴灑地面；2%過(guò)氧乙酸8ml/m3熏蒸1h。七、飲水的消毒（一）自來(lái)水用氯氣消毒（二）少量的飲用水可用漂白粉消毒八、環(huán)境的消毒（一）房間、地面、墻壁、門窗可用過(guò)氧乙酸或含氯消毒液（二）廁所、陰溝可用生石灰（三）垃圾可用焚燒/有效氯的消毒液噴灑（四）污水可用有效氯的消毒液噴灑一、微生物的種類（一）微生物對(duì)消毒滅菌敏感性高低的排序真菌、細(xì)菌繁殖體、有包膜病毒、無(wú)包膜病毒、分枝桿菌、細(xì)菌芽胞。（二）不同種或同種不同株間微生物內(nèi)在的抗性相差也很大從一種微生物得到的滅活數(shù)據(jù)不能推導(dǎo)到另一種微生物。一種可殺滅細(xì)菌的消毒劑，不一定能滅活病毒。滅活朊粒需要的能量是正常熱力滅菌的6倍！肝炎病毒（尤其乙肝病毒）比其他病毒和大多數(shù)細(xì)菌繁殖體對(duì)熱和消毒劑的抗性強(qiáng)。二、微生物的物理狀態(tài)微生物的生長(zhǎng)情況顯著影響它們的抵抗力。第四節(jié)影響消毒滅菌效果的因素三、微生物的數(shù)量微生物最初的數(shù)量越大，所需消毒的時(shí)間越長(zhǎng)。四、消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時(shí)間（一）消毒劑的性質(zhì)消毒劑的理化性質(zhì)不同對(duì)微生物的作用大小各異。例：表面活性劑對(duì)G+菌殺滅效果比對(duì)G-菌效果好；表面活性劑一般只能對(duì)細(xì)菌繁殖體有作用，不能殺滅細(xì)菌的芽胞和真菌；氧化劑中的過(guò)氧乙酸和含氯化合物對(duì)環(huán)境和空氣中的病毒作用效果好。（二）消毒劑的濃度同種消毒劑的濃度不同，其消毒效果也不同。絕大多數(shù)消毒劑在高濃度時(shí)殺菌作用強(qiáng)大，降低到一定濃度時(shí)，只有抑菌作用。乙醇或異丙醇例外。（三）作用時(shí)間消毒劑在一定濃度下，對(duì)細(xì)菌作用時(shí)間越長(zhǎng)消毒效果也越好。（四）溫度消毒劑的殺菌實(shí)質(zhì)上是化學(xué)反應(yīng)。其反應(yīng)速度隨溫度升高而加快。故溫度升高可提高殺菌效果。例：2%戊二醛殺滅104/ml炭疽芽胞時(shí)20℃需15min40℃需2min56℃僅需1min。六、酸堿度

消毒劑的殺菌作用受pH影響。例如：戊二醛本身呈酸性，其水溶液呈弱酸性，不能殺死芽胞。只有加入NaHCO3后才能起作用。苯扎溴銨的殺菌作用是pH越低，殺菌所需藥物濃度越高。pH3時(shí)所需的殺菌濃度較pH9時(shí)要高10倍。七、有機(jī)物環(huán)境中有機(jī)物存在，能夠顯著影響消毒劑的效果。有機(jī)物可阻礙消毒劑與病原菌接觸并消耗藥品。第五節(jié)病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全一、病原微生物的分類根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對(duì)個(gè)體或群體的危害程度分為4類：（一）第一類是能夠引起人類或動(dòng)物嚴(yán)重疾病、我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)或已經(jīng)宣布消滅的微生物（共29種）如：天花病毒、克里米亞-剛果出血熱（新疆出血熱）、埃博拉病毒、猴痘病毒、亨德拉病毒等。（二）第二類是能夠引起人類或動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物（70種）1.人間傳染的有：漢坦病毒、高致病性禽流感病毒、愛滋病毒（Ⅰ型和Ⅱ型）、乙型腦炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒（街毒）、SRAS冠狀病毒（Ⅰ型和Ⅱ型）、西尼羅病毒、炭疽芽胞桿菌、布魯菌屬、結(jié)核分枝桿菌、霍亂弧菌、鼠疫耶爾森菌等。（三）第三類是指能引起人或動(dòng)物疾病，但在一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳染風(fēng)險(xiǎn)有限，實(shí)驗(yàn)室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物（共275種）

人間傳染的有腺病毒、腸道病毒、鼻病毒、登革病毒、輪狀病毒、各型肝炎病毒、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、流行性感冒病毒、百日咳鮑特菌、伯氏疏螺旋體、胎兒彎曲菌、沙眼衣原體、破傷風(fēng)梭菌、致病性大腸埃希菌、腦膜炎奈瑟菌、傷寒沙門菌、志賀菌屬、表皮葡萄球菌、白假絲酵母菌等。（四）第四類是指在通常情況下不會(huì)引起人類或動(dòng)物疾病的微生物如小鼠白血病病毒。其中第一類和第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物

二、病原微生物實(shí)驗(yàn)室的分級(jí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原微生物的生物安全防護(hù)水平（biosafetylevel，BSL）及實(shí)驗(yàn)室安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室分為四級(jí)。病原微生物實(shí)驗(yàn)室分級(jí)級(jí)別處理對(duì)象一級(jí)對(duì)人體、動(dòng)植物或環(huán)境危害較低，不具有對(duì)健康成人、動(dòng)植物致病的致病因子二級(jí)

對(duì)人體、動(dòng)植物或環(huán)境具有中等危害或具有潛在危險(xiǎn)的致病因子，對(duì)健康成人、動(dòng)植物和環(huán)境不會(huì)造成嚴(yán)重危害，有有效的