WesternBlotting的原理方法及常見(jiàn)問(wèn)題分析WesternBlotting的原理試驗(yàn)前應(yīng)準(zhǔn)備的試劑及材料WesternBlotting試驗(yàn)步驟影響Westernblotting成功的要素常見(jiàn)問(wèn)題分析與對(duì)策南方醫(yī)科高校中醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)試驗(yàn)室一、概述通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)狀況的信息。WesternBlotting的原理

組織或細(xì)胞樣品蛋白的提取試劑蛋白定量試劑

丙烯酰胺凝膠配置試劑轉(zhuǎn)膜緩沖液試劑固相載體（PVDF\NC\尼龍膜）封閉液、洗脫液、抗體稀釋液一抗、二抗化學(xué)顯影液

二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備的試劑及材料

2.7

一抗二抗的選擇

2.7.1一抗的選擇

2.7.2二抗的選擇

二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備的試劑及材料

3.1組織或細(xì)胞樣品蛋白的提取a蛋白種類分類：胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、磷酸化蛋白線粒體蛋白等。b樣品來(lái)源分類：?jiǎn)螌淤N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞少量或微量組織樣品大量組織樣品難裂解組織樣品一般組織樣品

三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟

3.2蛋白定量考馬斯亮蘭法BCA法Lowry法BCA蛋白定量法操作：

三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟孔號(hào)012345678蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（μL）0124812162020去離子水（μL）20191816128400對(duì)應(yīng)蛋白含量（μg）00.51.02.04.06.08.010.？A+B（50：1）200200200200200200200200200振蕩30s，37℃30分鐘，A562nm測(cè)定。以蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算出蛋白含量。

3.3凝膠濃度的選擇及配置蛋白分子量(kDa)凝膠濃度(%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟3.4蛋白Marker的作用

預(yù)染或非預(yù)染各種分子量的蛋白，用于標(biāo)示電泳中蛋白的大小和示蹤，有利找準(zhǔn)自己的目的蛋白。

12%10%8%5%總體積10ml10ml10ml2ml超純水3.344.61.430%丙烯酰胺43.32.70.331.5MTirs2.52.52.50.2510%APS0.10.10.10.0210%SDS0.10.10.10.02TEMED0.0040.0040.0060.0036

3.6蛋白樣品變性（時(shí)間、溫度）3.6蛋白樣品上樣（依次、體積）3.7電泳

三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟？三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟3.8切膠、泡膠、疊膠

濾紙2張濾紙1張PVDF膜1張濾紙3張凝膠1塊陽(yáng)極Ⅰ陽(yáng)極Ⅱ陰極膠、濾紙、膜浸泡位置3.9轉(zhuǎn)膜時(shí)濾紙、膠、膜的疊加依次

三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟半干轉(zhuǎn)膜的條件：

分子量大小

電流=Sx3疊加示意圖正極負(fù)極3.10封閉

3.11洗脫3.12加一抗（抗體名稱、來(lái)源、濃度、時(shí)間）孵育

三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟

3.13洗脫3.14加二抗（抗體名稱、來(lái)源、濃度、時(shí)間）3.15孵育、洗脫3.16加ECL發(fā)光液三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟3.17結(jié)果的檢測(cè)及分析三、WesternBlotting試驗(yàn)步驟結(jié)果分析例圖1比較均一的高背景斑點(diǎn)、發(fā)泡式或閃爍式的高背景信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)非特異性條帶彌散型條帶白色條帶、黑點(diǎn)或信號(hào)下降太快常見(jiàn)問(wèn)題分析三、常見(jiàn)問(wèn)題分析高背景原因：解決辦法抗體濃度太高優(yōu)化/降低一抗和二抗?jié)舛瓤贵w孵育溫度過(guò)高4℃孵育封閉液不適合比較嘗試不同的封閉液封閉不完全封閉液的選擇與優(yōu)化增加封閉液中蛋白質(zhì)濃度優(yōu)化封閉時(shí)間和溫度（RT至少1小時(shí)；4°過(guò)夜）抗體與其它蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)更換不同的封閉液；降低二抗?jié)舛葯z測(cè)二抗與膜的交叉反應(yīng)性

高背景原因：解決辦法漂洗不完全增加漂洗時(shí)間和緩沖液體積漂洗液中加入Tween-20；濃度0.05％曝光時(shí)間太長(zhǎng)縮短曝光時(shí)間膜的問(wèn)題使用干凈鑷子；戴手套操作換一張新膜用足夠的液體，膜始終保持濕潤(rùn)孵育時(shí)使用脫色搖床避免膜重疊，互相覆蓋小心操作，勿毀損膜膜干燥保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象緩沖液污染使用新緩沖液過(guò)濾緩沖液高背景如圖所示:

信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)原因：解決辦法轉(zhuǎn)膜不完全1.轉(zhuǎn)膜后，染膠以決定轉(zhuǎn)膜效率2.保證轉(zhuǎn)膜時(shí)膠與膜充分結(jié)合(趕氣泡）3.濾紙－膜－膠，電極方向正確裝配4.電轉(zhuǎn)時(shí)防止過(guò)熱（加冰）5.使用陽(yáng)性對(duì)照或預(yù)染Marker6.優(yōu)化轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流7.保證樣品處理時(shí)，樣品不被破壞（抗原決定簇）蛋白質(zhì)與膜結(jié)合不充分1.小蛋白轉(zhuǎn)印增加電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的濃度至20%；2.大蛋白轉(zhuǎn)印降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的濃度至10%3.低分子蛋白質(zhì)透過(guò)膜；使用小孔徑膜（0.22u）一抗、二抗等不匹配一抗與組織種屬相匹配，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配。抗體增加抗體濃度；抗體與抗原結(jié)合差；抗體喪失活性抗原不足增加上樣量

信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)抗原被封閉液遮蔽試用不同的封閉液優(yōu)化封閉液中蛋白質(zhì)濃度縮短封閉時(shí)間緩沖液里有疊氮鈉去掉疊氮鈉底物孵育時(shí)間太短不少于2分鐘底物喪失活性ECL發(fā)光液的選擇及發(fā)光也的有效期底物與二抗孵育發(fā)光檢測(cè)保證兩種底物成分沒(méi)有交叉污染膜被剝離過(guò)剝離會(huì)導(dǎo)致抗原丟失或變性避免重復(fù)檢測(cè)膜上蛋白質(zhì)被消化（gelatin)封閉物質(zhì)可能有蛋白質(zhì)降解活性蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存過(guò)程中降解重新制備樣品信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)如圖所示：多非特異性條帶或條帶位置不對(duì)蛋白表達(dá)模式的分化使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或平行實(shí)驗(yàn)體內(nèi)表達(dá)的蛋白具有多種修飾形式查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小蛋白樣本降解新鮮制備，并使用蛋白酶抑制劑一抗?jié)舛冗^(guò)高降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶二抗?jié)舛冗^(guò)高產(chǎn)生非特異性結(jié)合降低抗體濃度，選擇特異性更強(qiáng)二抗抗體未純化單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶蛋白存在二聚體或多聚體電泳上樣前，煮沸10min，增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性？多非特異性條帶或條帶位置不對(duì)如圖所示:彌散型條帶原因：解決辦法：抗體濃度太高降低抗體濃度電泳時(shí)電壓過(guò)大降低電泳時(shí)電壓（100v）蛋白質(zhì)上樣量太多降低蛋白質(zhì)上樣量其他常