生化藥物制造工藝第一節氨基酸類藥物一、氨基酸類藥物的基本知識從各種生物體中發現的氨基酸已有180多種，但是參與蛋白質組成的常見氨基酸或稱基本氨基酸只有20種。一些特殊的天然氨基酸大多數是不參與蛋白質組成的，這些氨基酸被稱為非蛋白質氨基酸。氨基酸是構成機體蛋白質的基本單位，且構成生物體蛋白質的氨基酸都是α-氨基酸，除甘氨酸外，α-碳原子均為不對稱碳原子，具有立體異構現象，均是L-型氨基酸。分類：

（1）根據氨基酸在pH5.5溶液中帶電狀況分為酸性、中性及堿性氨基酸三類。

（2）依R基團差異亦分為：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸及雜環氨基酸三類。其中L-組氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸及L-羥脯氨酸為雜環氨基酸；

L-酪氨酸及L-苯丙氨酸為芳香族氨基酸；其余均為脂肪族氨基酸。氨基酸的理化性質是蛋白質與氨基酸合成、轉化、分離純化及定性定量檢測的依據。二、氨基酸及其衍生物在醫藥中的應用

1、氨基酸是構成蛋白質的基本組成單位，故生物體中眾多蛋白質的生物功能，無不與構成蛋白質的氨基酸種類、數量、排列順序及由其形成的空間構象有密切的關系。因此氨基酸對維持機體蛋白質的動態平衡有極其重要的意義。生命活動中人及動物通過消化道吸收氨基酸。通過體內轉化而維持其動態平衡，若其動態平衡失調，則機體代謝紊亂，甚至引起病變。2、許多氨基酸尚有其特定的藥理效應。（－）氨基酸的營養價值及其與疾病治療的關系氨基酸為構成天然蛋白質的基本單位，故蛋白質營養價值實際是氨基酸作用的反映。健康人靠膳食中的蛋白質獲取各種氨基酸滿足機體需求。缺乏蛋白質則影響機體生長及正常生理功能，抗病力減弱引起病變。消化道功能嚴重障礙者及手術后病人常因禁食無法獲得足夠蛋白質，自身蛋白質過量消耗，致使營養不良而導致病情惡化或預后不良。臨床上常通過直接輸入氨基酸制劑改善患者營養狀況，增加治療機會，促進康復。

賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸等8種氨基酸為必須氨基酸。必需氨基酸：人及哺乳動物自身不能合成，需由食物供應。非必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）可分別由其他氨基酸（蛋氨酸和苯丙氨酸)產生，若食物中提供了足夠的該氨基酸（胱氨酸及酪氨酸），可減少對其他氨基酸（蛋氨酸及苯丙氨酸）的需求量。氨基酸（精氨酸及組氨酸）合成速度較低，通常難以滿足需求，需由外界補充一部分。

（二）治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物（三）治療肝病的氨基酸及其衍生物（四）治療腦及神經系統疾病的氨基酸及其衍生物（五）用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物（六）其它氨基酸類藥物的臨床應用氨基酸類藥物的生產方法

1、目前全世界天然氨基酸的年總產量在百萬噸左右，其中產量較大者有谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸，其次為天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它們主要用于醫藥、食品、飼料及化工行業中。

2、目前構成天然蛋白質的20種氨基酸的生產方法有天然蛋白質水解法、發酵法、酶轉化法及化學合成法等四種。

3、氨基酸及其衍生物類藥物已有百種之多，但主要是以20種氨基酸為原料經酯化、?；?、取代及成鹽等化學方法或酶轉化法生產。一、水解法（一）基本原理與過程以毛發、血粉及廢蠶絲等蛋白質為原料，通過酸、堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經分離純化獲得各種藥用氨基酸的方法稱為水解法。目前用水解法生產的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸及L-絲氨酸等。水解法生產氨基酸的主要過程為水解、分離和結晶精制三個步驟。

1、蛋白質水解方法目前蛋白質水解分為酸水解法、堿水解法及酶水解法三種。（1）酸水解法蛋白質原料用6～10mol／L鹽酸或8mol／L硫酸于110～120℃（回流煮沸）水解12～24h，除酸后即得多種氨基酸混合物。優點是水解迅速而徹底，產物全部為L-型氨基酸，無消旋作用。缺點是色氨酸全部被破壞，絲氨酸及酪氨酸部分被破壞，且產生大量廢酸污染環境。（2）堿水解法蛋白質原料經6mol／L氫氧化鈉或4mol／L氫氧化鋇于100℃水解6h即得多種氨基酸混合物。該法水解迅速而徹底，且色氨酸不被破壞，但含羥基或巰基的氨基酸全部被破壞，且產生消旋作用。工業上多不采用。（3）酶水解法蛋白質原料在一定pH和溫度條件下經蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的過程稱為酶水解法。此法優點為反應條件溫和，無需特殊設備，氨基酸不破壞，無消旋作用。缺點是水解不徹底，產物中除氨基酸外，尚含較多肽類。工業上很少用該法生產氨基酸而主要用于生產水解蛋白及蛋白胨。2、氨基酸分離方法

氨基酸分離方法較多，通常有溶解度法、等電點沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。

（1）溶解度法是依據不同氨基酸在水中或其它溶劑中的溶解度差異而進行分離的方法。胱氨酸和酪氨酸均難溶于水，但在熱水中酪氨酸溶解度較大，而胱氨酸溶解度變化不大，故可將混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開。

（2）特殊試劑沉淀法系采用某些有機或無機試劑與相應氨基酸形成不溶性衍生物的分離方法。如鄰二甲苯-4-磺酸能與亮氨酸形成不溶性鹽沉淀，后者與氨水反應又可獲得游離亮氨酸；

組氨酸可與HgC12形成不溶性汞鹽沉淀，后者經處理后又可獲得游離組氨酸；

精氨酸可與苯甲醛生成水不溶性苯亞甲基精氨酸沉淀，后者用鹽酸除去苯甲醛即可得精氨酸。

（3）吸附法是利用吸附劑對不同氨基酸吸附力的差異進行分離的方法。如顆?；钚蕴繉Ρ奖彼帷⒗野彼峒吧彼岬奈搅Υ笥趯ζ渌欠枷阕灏被岬奈搅Γ士蓮陌被峄旌弦褐袑⑸鲜霭被岱蛛x出來。

（4）離子交換法是利用離子交換劑對不同氨基酸吸附能力的差異進行分離的方法。氨基酸為兩性電解質，在特定條件下，不同氨基酸的帶電性質及解離狀態不同，故同一種離子交換劑對不同氨基酸的吸附力不同。3、氨基酸的精制方法

分離出的特定氨基酸中常含有少量其它雜質，需進行精制，常用的有結晶和重結晶技術，也可采用溶解度法或結晶與溶解度法相結合的技術。丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度較小，且pI為6.0，故丙氨酸可在pH6.0時，用50％冷乙醇結晶或重結晶加以精制。

溶解度與結晶技術相結合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若將含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍體積（w／v）的熱水中，調pH4.0左右，經脫色過濾可除去大部分酪氨酸；濾液濃縮至原體積的1／3，加2倍體積（v／v）的95％乙醇，4℃放置，濾取結晶，用95%乙醇洗滌，烘干即得苯丙氨酸精品。（二）用水解法生產氨基酸的品種及工藝

絕大多數氨基酸均可采用酸水解法生產，但目前由于發酵方法及酶工程技術的迅速發展，僅有幾種氨基酸仍采用酸水解法生產。L-胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制備（1）L-胱氨酸的結構與性質

L-胱氨酸存在于所有蛋白質分子中，尤以毛、發及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由兩分子半胱氨酸脫氫氧化而成，結構為：

L-胱氨酸在稀酸中形成六角形或六角柱形晶體，分解點258~261℃，pI為5.05，〔α〕25D為-232°。在25℃水中溶解度為0.011，在75℃水中為0.052。溶于無機酸及無機堿，在熱堿液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮?？杀贿€原為L-半胱氨酸。（2）工藝路線（3）工藝過程①水解

110～117℃水解7h（自100℃時計）后出料,玻璃布過濾,收集濾液。②中和直至pH4.8，靜置36h，滌綸布濾取沉淀，離心甩干得L-胱氨酸粗品。③粗制升溫至65～70℃，攪拌半小時，加活性炭16kg，于80～90℃保溫半小時，濾除活性炭。調濾液至pH4.8，靜置結晶，吸出上清液后，底部沉淀經離心甩干得胱氨酸粗品（Ⅱ）。④精制中和升溫至70℃，加活性炭1.5～2.5kg，85℃攪拌半小時，過濾，加1.5倍體積蒸餾水，升溫至75～80℃，攪拌下用12％氨水（化學純）中和至pH3.5～4.0，析出結晶，濾取胱氨酸結晶，蒸餾水洗至無氯離子，真空干燥得L-胱氨酸成品。（4）檢驗應為六角形或六角柱形白色結晶，含量在98.5％以上，干燥失重小于0.5％，熾灼殘渣小于0.2％，氯化物小于0.15％，鐵鹽小于0.001％，重金屬小于20ppm。含量測定：（5）作用與用途

L-胱氨酸具有增強造血機能、升高白細胞、促進皮膚損傷的修復及抗輻射作用。臨床上用于治療輻射損傷、重金屬中毒、慢性肝炎、牛皮癬及病后或產后繼發性脫發。二、發酵法

（－）基本原理與過程

1、發酵的基本原理生物化學中稱酵母無氧呼吸過程為發酵，反應過程中電子供體與受體皆為有機物，有時電子受體為電子供體的分解產物，氧化作用不完全，最終形成還原性產物。工業上，發酵實質上是利用微生物細胞中酶的作用，將培養基中有機物轉化為細胞或其它有機物的過程。

★初生氨基酸：微生物通過固氮作用、硝酸還原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相應的氨基酸，或微生物通過轉氨酶作用，將一種氨基酸的氨基轉移到另一種酮酸上，生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸。

★次生氨基酸：在微生物作用下，以初生氨基酸為前體轉化成的其它氨基酸。大多數氨基酸均可通過以初生氨基酸為原料的微生物轉化作用而產生。

2、發酵法的基本過程

⑴

發酵法生產氨基酸的基本過程包括培養基配制與滅菌處理，菌種誘變與選育，菌種培養、滅菌及接種發酵，產品提取及分離純化等步驟。現代生物工程采用細胞融合技術及基因重組技術改造微生物細胞，已獲得多種高產氨基酸雜種菌株及基因工程菌。如用北京棒狀桿菌和鈍齒棒狀桿菌原生質體融合形成的雜種，其中70％雜種細胞產生兩親菌株所產生的氨基酸。⑵

氨基酸發酵方式主要是液體通風深層培養法，其過程是由菌種試管培養逐級放大直至數噸至數百噸發酵罐。發酵結束，除去菌體，清液用于提取、分離純化和精制有關氨基酸，其分離純化、精制方法及過程與水解法相同。

（二）發酵法生產的氨基酸品種及工藝

構成動物、植物及微生物體所有蛋白質的氨基酸種類與構型均無任何差異，但植物體內所有氨基酸皆由CO2、氨和水合成，動物體除8種必需氨基酸需從外界攝取外，其余非必需氨基酸均可通過體內氨基酸之間的轉化或碳水化合物中間代謝物而合成，而微生物利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。目前絕大部分氨基酸皆可通過發酵法生產，其缺點是產物濃度低，設備投資大，工藝管理要求嚴格，生產周期長，成本高。現以L-賴氨酸直接發酵法為例，說明發酵法的基本過程。L-賴氨酸（L-Lysine，L-Lys）的制備

（1）L-賴氨酸的結構和性質L-賴氨酸存在于所有蛋白質中，為人體必需氨基酸之一。分子量為146.20，結構為：

L-Lys自乙醇水溶液中得針狀結晶，其鹽酸鹽為單斜晶系白色粉末，無臭、味苦，熔點263～264℃，易溶于水，幾乎不溶于乙醇和乙醚。PI為10.56。（2）工藝路線（3）工藝過程①

菌種培養菌種為北京棒狀桿菌（corymebacterium

perkinense）ASl.563。斜面培養基成分（％）為:葡萄糖0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨0.5，瓊脂2.0，pH7.0。種子培養基成分（%）為:葡萄糖2.0，磷酸氫二鉀0.1，硫酸鎂0.05，硫酸銨0.4，玉米漿2.0，毛發水解廢液1.0，pH6.8～7.0，CaCO30.5。

1000ml三角瓶中種子培養基裝量200ml，接種一環斜面培養菌種，30℃振搖（沖程7.6cm，頻率108次／min），培養16h。二級種子培養接種量2.5％，培養48h。如此逐級擴大培養。②

滅菌、發酵發酵培養液成分（％）為淀粉水解糖13.5，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂0.05，硫酸銨1.2，尿素0.4，玉米漿1.0，毛發水解廢液1.0，甘蔗糖蜜2.0，pH6.7，滅菌前加甘油聚醚lL（指5m3發酵罐）。在5m3發酵罐中投入培養液3噸，在1.01×105Pa壓力下，加熱至118～120℃滅菌30min，立即通入冰鹽水冷卻至30℃，按10％（v／v）比例接種，以1:0.6（v／v）通氣量于30℃發酵42～51h，攪拌速度為180轉／min。③發酵液處理：離心除菌體；80℃加熱；④離子交換：銨型732樹脂;PH=5.0為飽和(串聯)⑤濃縮結晶：收集PH=8.0～14.0洗脫液（氨水洗脫）三、酶轉化法

（一）基本原理及過程

酶轉化法亦稱為酶工程技術，實際上是在特定酶的作用下使某些化合物轉化成相應氨基酸的技術。

酶工程法與直接發酵法生產氨基酸之反應本質相同，皆屬酶轉化反應，但前者為單酶或多酶的高密度轉化，而后者為多酶低密度轉化。

酶工程技術工藝簡單，產物濃度高，轉化率及生產效率較高，副產物少。

固定化酶或細胞可進行連續操作，節省能源和勞務，并可長期反復使用。（二）酶轉化法生產的氨基酸品種及工藝目前醫藥工業中，用酶工程法生產的氨基酸已有十多種。

DL-纈氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-丙氨酸及DL-蘇氨酸等分別經氨基?；覆鸱肢@得了相應的L-氨基酸，并已投入了工業化生產。L-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備

（1）L-天冬氨酸及L-丙氨酸的結構與性質

①L－天冬氨酸（L-Asparticacid，Asp）的結構與性質L-Asp存在于所有蛋白質分子中，含兩個羧基和一個氨基，為酸性氨基酸，分子式為C4H7NO4，分子量為133.10，結構式為：

L-Asp的化學名稱為α-氨基丁二酸或氨基琥珀酸，純品為白色菱形葉片狀結晶，等電點為2.77，熔點為269～271℃。溶于水及鹽酸，不溶于乙醇及乙醚，在25℃水中溶解度為0.8，在75℃水中為2.88，在乙醇中為0.00016。在堿性溶液中為左旋性，在酸性溶液中為右旋性?！拨痢?5D為+5.05°（C＝0.5～2.0，在水中），〔α〕25D為+25.4°（C＝0.5～2.0，在5mol／LHCl中）。

②L-丙氨酸（L-Alanine，簡稱L-Ala）的結構與性質

L-Ala存在于所有蛋白質分子中,為中性氨基酸。分子式為C3H7NO2，分子量為89.09，結構式為：

L-Ala自水和乙醇中形成菱形結晶，等電點為6.0，分解點為297℃，在25℃水中溶解度為16.65，在75℃水中為28.5，在20℃乙醇中為0.16，不溶于丙酮及乙醚?！拨痢?5D為+18°（C＝0.5～2.0，在水中），〔α〕25D為-14.6°（C＝0.5～2.0，在5mol／LHCl中）。（2）L-Asp和L-Ala的酶轉化反應

（3）工藝路線固定化酶凡限制在一定的空間范圍內并能連續反復的使用的酶都稱為固定化酶。通常采用的固定化方法可大體概括為四種類型：吸附法、共價偶聯法、交聯法和包埋法。

吸附法這是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達到固定目的的方法，又可分：物理吸附和離子交換吸附。物理吸附是通過氫鍵、疏水鍵和π－電子親和力等物理作用力將酶固定于不溶性載體的方法。常用的載體有：皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠和微孔玻璃等無機吸附劑，纖維素、膠原、賽珞玢以及火棉膠等有機吸附劑。最常用的交換劑有CM（羧甲基）－纖維素、DEAE（二乙基氨基乙基）－纖維素、DEAE－葡聚糖凝膠等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑，約50～150mg蛋白／g載體。共價偶聯法這是借助共價鍵將酶的活性非必需側鏈基團和載體的功能基團進行偶聯以制備固定化酶的方法。常用的載體有：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐共聚物、聚苯乙烯、尼龍等；還有無機載體如多孔玻璃等。交聯法利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶分子與惰性蛋白間、或酶分子與載體間進行交聯反應以共價鍵制備固定化酶。包埋法將聚合物的單體和酶溶液混合后，再借助聚合促進劑（包括交聯劑）的作用進行聚合，將酶包埋于聚合物中以達到固定化的目的。（1）膠格包埋最常用的包埋劑是聚丙烯酰胺凝膠，它以丙烯酰胺為單體、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑聚合而成。（2）微囊型包埋是用直徑幾十到幾百微米、厚約25nm的半透膜將酶分子進行包埋固定化的方法。（3）脂質體包埋脂質體是指具有脂雙層結構和一定包裹空間的微球體。輔酶及偶聯酶的固定化輔酶物質的固定化一般采用載體共價偶聯法。（4）工藝過程

①菌種培養

大腸桿菌（Esscherichiacoli）AS1.881的培養

斜面培養基為普通肉汁培養基；

搖瓶培養基成分（％）為玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，MgSO4·7H2O0.02，氨水調pH6.0,煮沸后過濾，500ml三角燒瓶中培養基裝量50～100m1。從新鮮斜面上或液體中培養種子，接種于搖瓶培養基中，37℃振搖培養24h，逐級擴大培養至1000～2000L規模。培養結束后用1mol／LHCl調pH5.0，升溫至45℃并保溫1h，冷卻至室溫，轉筒式高速離心機收集菌體（含天冬氨酸酶），備用。德阿昆哈假單胞菌（Pseudomonasdacunhae）68變異株的培養斜面培養基組成（％）為蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaC10.5，pH7.0，瓊脂2.0。種子培養基與斜面培養基相同，唯不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養基裝量為40m1。搖瓶培養基組成（％）為L-谷氨酸3.0，蛋白胨0.9，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氯鉀0.05，MgSO4·7H2O0.01，用氨水調pH7.2，500ml三角瓶中培養基裝量為80ml。將培養24h的新鮮斜面菌種接種于種子培養基中，30℃振搖培養8h，再接種子搖瓶培養基中，30℃振蕩培養24h，如此逐級擴大至1000～2000L的培養罐培養。培養結束后用1mol／LHCl調pH至4.75，于30℃保溫1h，用轉筒式高速離心機離心收集菌體（含L-天冬氨酸-β-脫羧酶），備用。

②細胞固定E·coli的細胞固定取濕菌體20kg懸浮于80L，生理鹽水（或離心后的培養清液）中，保溫至40℃，再加入90L保溫至40℃的12％明膠溶液及10L1.0％戊二醛溶液，充分攪拌均勻，放置冷卻凝固，再漫于0.25％戊二醛溶液中。于5℃過夜后，切成3～5mm的立方小塊，浸于0.25％戊二醛溶液中5℃過夜、蒸餾水充分洗滌，濾干得含天冬氨酸酶的固定化E.coli，備用。假單胞菌體固定

取濕菌體20kg，加生理鹽水攪勻并稀釋至40L，另取溶于生理鹽水的5％角叉菜膠溶液85L，兩液均保溫至45℃后混合，冷卻至5℃成膠。浸于600L2%KCl和0.2mol／L己二胺的0.5mol／LpH7.0的磷酸緩沖液中，5℃下攪拌10分鐘，加戊二醛至0.6mol／L濃度，5℃攪拌30分鐘，取出切成3～5mm的立方小塊，用2%KCl溶液充分洗滌后，濾去洗滌液，即得含L-天冬氨酸-β-脫羧酶的固定化細胞，備用。

④轉化反應將保溫至37℃的lmol／L延胡索酸銨（含1mmol／LMgC12，pH8.5）底物溶液按一定空間速度（Sv）連續流過生物反應堆I，控制達到最大轉化率（＞95％）為限度，收集轉化液制備L-Asp或用于生物反應堆Ⅱ的再轉化。當需要生產L-丙氨酸時，向上述轉化液中加磷酸吡哆醛至0.1mmol／L濃度，調pH6.0，保溫至37℃，按一定空間速度流入1.515×105Pa壓力下的生物反應堆Ⅱ，控制達到最大轉化率（＞95％）為限，收集轉化液，用于制取L-丙氨酸。產品純化與精制

生物反應堆Ⅰ轉化液經過濾澄清，攪拌下用1mol／LHCl調pH2.8，5℃結晶過夜，濾取結晶，用少量冷水洗滌抽干，105℃干燥得L-Asp粗品。粗品用稀氨水溶解（pH5）成15％溶液，加1%（w／v）活性炭，70℃攪拌脫色1h過濾,濾液于5℃結晶過夜，濾取結晶，85℃真空干燥得藥用L-Asp。

生物反應堆Ⅱ轉化液過濾澄清，于60～70℃下減壓濃縮至原體積的50％，冷卻后加等體積甲醇，5℃結晶過夜，濾取結晶并用少量冷甲醇洗滌抽干，80℃真空干燥得L-Ala粗品。粗品用3倍體積（w／v）去離子水于80℃攪拌溶解，加0.5%（w／v）藥用活性炭于70℃攪拌脫色1h，過濾，濾液冷后加等體積甲醇，5℃結晶過夜，濾取結晶，于80℃真空干燥得藥用L－Ala。（5）檢驗

（6）作用與用途

L-Asp有助于鳥氨酸循環，促進氨和CO2生成尿素，降低血中氨和CO2,增強肝功能，消除疲勞，用于治療慢性肝炎、肝硬化及高血氨癥。同時L-Asp和L-Ala都是復合氨基酸輸液的原料。

2、酶拆分法制備L-苯丙氨酸

（1）L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-phe）的結構與性質L-phe，存在于所有蛋白質中，為人體必需氨基酸之一，其分子式為C9H11NO2，分子量為165.19，結構為：

L-Phe自水中結晶成白色葉片狀晶體，無臭，微苦，pI為5.48；分解點為283～284℃。在25℃水中溶解度為2.96，在75℃水中為6.62，微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。1%水溶液pH為5.4～6.0?！拨痢?5D為-4.47°（C＝0.5～2.0，在5mol／LHCl中），〔α〕25D為-34.5°（C＝0.5~2.0，在水中）。（2）酶拆分DL-Phe的原理：DL-Phe與醋酸酐反應生成乙酰-DL-Phe（Ac-DL-Phe），氨基酰化酶可專一性水解Ac-L-Phe的酰胺鍵生成L-Phe，而不水解Ac-D-Phe酰胺鍵，再利用L-Phe與Ac-D-Phe在水中溶解度的差異進行分離。

Ac-D-Phe又可經消旋生成Ac-DL-Phe，再行水解和分離，如此反復進行，可將DL-Phe全部轉化為L-Phe。DL-Phe拆分的基本反應過程如下：（3）工藝路線

（4）工藝過程

①固定化氨基?；傅闹苽淙EAE-SephadexA-50于去離子水中充分浸泡后，依次用10倍量0.5mol／LHCl和0.5mol／LNaOH溶液攪拌處理30min，再用去離子水洗至中性，然后依次用0.1mol／L及0.01mol／L的pH7.0磷酸緩沖液處理1～2h，濾干備用。另取培養40～50h的米曲擴大曲用6倍量去離子水分兩次抽提，濾去殘渣。濾液用2mol／LNaOH溶液調pH6.7~7.0，按100L酶液加1kg已處理的濕DEAE-SephadexA-50的比例混合，于0～4℃攪拌吸附4～5h，濾取DEAE-SephadexA-50，依次用去離子水、0.1mol／L醋酸鈉、0.01mol／L的pH7.0磷酸緩沖液洗滌3～4次，濾干得固定化氨基?；福?％甲苯后于冷庫中貯存，備用。

②Ac-DL-Phe的制備將DL-Phe、冰醋酸及醋酸酐按1∶7∶1（w／V／v）的比例加入反應釜中，90℃反應4～5h，回收醋酸，濃縮液加一定量去離子水，再濃縮至一定體積，冷卻結晶，濾取結晶于60℃真空干燥得Ac－DL－Phe。③酶水解

在1000L反應罐中加700L0.1mol／LAc-DL-Phe鈉鹽溶液，攪拌下滴加6mol／LHCl至pH6.7～7.0，加15～20kg固定化氨基?；?，50℃反應4～5h，過濾，濾液待分離L－Phe，固定化酶再用于轉化。

④分離純化上述濾液用6mol／LHCl調至pH4.8～5.1，減壓濃縮至35L左右，濃縮液于0℃結晶過夜，濾取結晶并用10L冷乙醇洗滌三次，抽干,于80℃烘3~4h，得L－Phe粗品。濾液和洗滌液合并后減壓濃縮至20L左右，得Ac-D-Phe溶液，待消旋和再轉化。

⑤精制取50L去離子水于100L反應罐中，加熱至95~100℃，投入5kgL－Phe粗品，攪拌溶解，加藥用活性炭0.25kg，攪拌脫色3min。趁熱過濾，濾液轉移至200L結晶罐中，冷卻至40℃，加50L40℃95％乙醇，用6mol／LHCl調pH5.5，于0℃結晶過夜，濾取結晶，用10L冷乙醇洗滌3～4次，抽干，于80℃干燥3～4h。母液濃縮回收L-Phe結晶，所得結晶如上法重結晶一次，得藥用L－Phe。結晶母液及洗滌液合并,減壓濃縮后轉入粗品母液，待消旋。

Ac－D－Phe的消旋上述粗品及精品L-Phe母液及洗滌液合并后濃縮至60L,于100L反應罐中在攪拌下緩緩加入醋酸酐18.5L，在25～45℃攪拌反應30min，冷卻至室溫，放置6h，用濃鹽酸調PHl.5～2.0，5℃結晶過夜，濾取結晶，用去離子水洗滌3～5次，每次20L，抽干，于40℃真空干燥得Ac－DL－Phe。

（5）檢驗應為白色葉片狀結晶，其含量應在98.5％～101.5％之間，〔α〕25D為-32.3°～+34.3°，1％水溶液pH為5.4～6.0，干燥失重應不超過0.3％，熾灼殘渣應不超過0.4％，氯化物、硫酸鹽及重金屬均與異亮氨酸規定相同，砷鹽應不超過1.5ppm，鐵鹽應不超過0.003%。

含量測定：（6）作用與用途

L-苯丙氨酸為復合氨基注射液的重要原料之一，也是合成苯丙氨酸氮芥及對氟苯丙氨酸等抗癌藥的原料。四、化學合成法

（一）基本原理與過程以α-鹵代羧酸、醛類、甘氨酸衍生物、異氰酸鹽、乙酰氨基丙二酸二乙酯、鹵代烴、α-酮酸及某些氨基酸為原料，經氨解、水解、縮合、取代及氫化還原等化學反應合成α-氨基酸的方法稱為化學合成法。一般合成法和不對稱合成法兩大類。

一般合成法包括鹵代酸水解法、氰胺水解法、乙酰氨基丙二酸二乙酯法、異氰酸酯（鹽）合成法及醛縮合法等；產物皆為DL-型氨基酸混合物。

不對稱合成法包括直接合成、α-酮酸反應及不對稱催化加氫等方法。產物為L-型氨基酸。（二）化學合成法生產的氨基酸品種及工藝

理論上所有氨基酸皆可由化學合成法制造，但在目前，只有當采用其它方法生產很不經濟時才采用化學合成法生產，如甘氨酸、DL-蛋氨酸及DL-丙氨酸等。

1、L-脯氨酸（L-Proline，L-Pro）的制備

（1）L-脯氨酸的結構與性質

L-脯氨酸存在于所有蛋白質中，雞毛中含量較豐富。其化學名稱為吡咯啶-α-甲酸或吡啶烷環-2-羧酸，分子式為C5H9NO2，分子量為115.13。

L-Pro自乙醇-乙醚中得白色粉末狀結晶，pI為6.3，熔點220～222℃。極易溶于水，不溶于乙醇及乙醚。有旋光。（2）合成路線

:L-Pro可采用化學合成法、發酵法及蛋白質原料水解分離法生產，合成法也有不同的原料和工藝。以濃硫酸為脫水劑，使L-谷氨酸與乙醇縮合成L-谷氨酸-γ-乙酯，后者經硼氫化鉀還原即成L-Pro。反應過程（3）工藝路線五氯酚乙醇溶液得復鹽沉淀。3%氨水解析乙醚去雜質。含量測定：

2、L-蘇氨酸（L-Threonine，L-Thr）的制備（1）L-蘇氨酸的結構與性質L-蘇氨酸存在于所有蛋白質中，為人體必需氨基酸之一。其分子式為C4H9NO3，分子量為119.12，

L-Thr純品為白色結晶或結晶性粉末，無臭，微甜，等電點為6.16,熔點為255～257℃，溶于水，不溶于乙醇、乙醚及氯仿。在堿液中不穩定，受熱易分解為甘氨酸和乙醛。

L-Thr分子中有兩個不對稱碳原子，故有L－D－Thr和L－D別蘇氨酸四種異構體，唯L-Thr具有生理活性。（2）合成路線:L-Thr的合成原料為甘氨酸和乙醛。甘氨酸先與堿式硫酸銅反應生成甘氨酸銅，后者在堿性條件下與乙醛縮合成DL-Thr銅，并以播種結晶法（優先結晶法）拆分得L-Thr和D-Thr。反應過程為：（3）工藝路線

拆分取72L去離子水、20kgDL-Thr精品及2.25kgD-THr于200L反應罐中，攪拌下迅速升溫到95℃至全溶，再迅速降溫至40℃，投入225gD-Thr結晶，緩緩降溫至29～30℃，迅速過濾，濾餅于80℃，烘干得D-Thr粗品。濾液再投入與已分出的D-Thr等量的DL-Thr，余操作與拆分D-Thr相同，投入225gL-Thr結晶，最后得L-蘇氨酸粗品。母液再投入適量D-Thr、DL-Thr及水，令三者比例為1:0.9∶3.2。氨基酸輸液

多種結晶L-氨基酸依特定比例混合制成的靜脈內輸注液謂之氨基酸輸液。氨基酸輸液可直接注入進食不足者的血液中，促進蛋白質、酶及肽類激素的合成，提高血漿蛋白濃度與組織蛋白含量，維持氮平衡，調節肌體正常代謝?，F已有含氨基酸數目為11、14、18及20種等多種輸液類型，氨基酸濃度分別有3％、5％、9％、10％及12％等多種規格。有些氨基酸輸液還加入山梨醇、木糖、維生素、Na＋、K＋、Ca2+或Mg2+等成分，以補充能量，提高氨基酸的利用率及其營養價值，也有些氨基酸輸液與右旋糖酐配伍制成較理想的代血漿。一、氨基酸輸液的組成與要求輸入人體的氨基酸種類、數量及比例需符合機體要求，否則利用度將下降，還會引起代謝失調、拮抗及中毒等代謝并發癥。

（一）組方原理體內蛋白質處于連續分解與合成的動