酵母發酵法制備超氧化物歧化酶1aSOD的用途SOD在食品工業中，作為保健食品的功效因子或食品營養強化劑，該保健品具有良好的抗衰老、抗炎、抗輻射、抗疲勞等保健強身的效果。目前已有添加SOD的蛋黃醬、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁飲料、礦泉水、奶糖、酸牛乳、冷飲類等類型的保健食品面市。制成多種劑型的SOD或復合型食品。已有SOD膠囊劑、片劑、口服液、脂質體、顆粒劑等形式的SOD保健食品。SOD可作為罐頭食品，果汁、啤酒等的抗氧劑，防止過氧化物酶引起的食品變質及腐敗現象。此外，還可作為水果、蔬菜的保鮮劑。研究證實，SOD添加于化妝品中可起到四方面的作用：一是有明顯的防曬效果；二是SOD作為抗氧化酶能有效防止皮膚衰老、祛斑、抗皺；三是有明顯的抗炎效果，對防治皮膚病有一定效果；四是SOD具有一定的防治瘢痕形成的作用。2aSOD的使用現狀自1969年McCord和Fridovich首次從牛紅細胞中分離出超氧化物歧化酶（SOD）以來，人們相繼從牛、豬、羊、馬等動物紅細胞、肌肉、肝臟組織以及植物中分離和純化出SOD。國外已有多種藥用SOD應用于臨床，主要集中在抗炎、抗輻射、抗腫瘤、抗衰老老及由超氧陰離子自由基引發疾病自身免疫性疾病等。目前，國內SOD的應用主要集中在食品和化妝品等方面，在吸收機制質量穩定性、有效性等方面的基礎研究取得一些新進展。國內現有SOD產品主要是從牧畜血液中提取，發酵法生產還未產業化。3aSOD性質超氧化物歧化酶是廣泛存在于動物、植物及微生物細胞內的金屬酶，至少可分為三種類型：Cu，Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD。該酶系一種酸性蛋白質，較穩定，能耐熱。pH7.6~9時穩定，pH6以下和12以上不穩定，pH2以下極度不穩定。具有較強的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。4a工藝流程5a工藝簡要介紹發酸罐中發酵培養：平皿上挑取取H2O2

性能好的單個菌落，經斜面培養、液體培養（一級）、擴大培養（二級）后，按10%的量接入發酵罐（2L）中通氣培養。每隔2h取樣一次，于650mm處測定發酵液的OD值，當OD值恒定而有下降趨勢時，放出發酵液，離心收集菌體供提取SOD。酵母菌中SOD的提取及純化：將離心分離得到的酵母菌體，懸浮于緩沖液（50mM磷酸鉀緩沖液，0.3M海藻糖，10M氯化鎂，pH7.0~7.5）中，用蝸牛酶酶解后，超聲波破碎細胞壁，菌體碎片再用DNaseⅠ酶酶解，離心除去殘渣，得粗酶提取液；在攪拌下加入乙醇-氯仿（5∶3）溶液，離心除去雜蛋白；再加入磷酸氫二鉀鹽析；上清液加入0.75倍冷丙酮，冷凍離心得粗酶沉淀；將沉淀溶于pH7.8磷酸鉀（2.5mM）緩沖液中透析1~2d，即得Cu，Zn-SOD酶液。6a個別試劑用途解釋0.3M海藻糖：本來是0.5M的蔗糖的，但經過查找文獻，發現不同濃度的海藻糖對SOD均有較強的保護作用，其中濃度在0.3mol/L時效果最佳，而蔗糖對SOD既無激活作用也沒抑制作用，所以改成了海藻糖。DNaseI：即DeoxyribonucleaseI，中文名稱為脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。DNaseI水解單鏈或雙鏈DNA后的產物，5'端為磷酸基團，3'端為羥基。10M氯化鎂溶液：是DNaseI激活劑。DNaseI活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNaseI可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點。蝸牛酶：是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶。

蝸牛酶是很有價值的一種酶。它可以用于酵母細胞壁的破碎7aSOD酶活力測定

在一般情況下，SOD活性測定只能應用間接活性測定法。其測定方法很多，常見的有化學法、免疫法和等電點聚焦法。其中化學法應用最普遍，化學法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產生有色中間物和O2

-，利用SOD分解而間接推算酶活力。

在化學方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學發光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學擴增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實用。本實驗采用鄰苯三酚自氧化方法。8a鄰苯三酚自氧化法原理鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2

-

（超氧陰離子自由基），生成帶色的中間產物（紅桔酚），反應開始后反應液先變成黃棕色，幾分鐘后轉綠，幾小時后又轉變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結果。本實驗中測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30～45s后，與時間成線性關系，一般線性時間維持在4min的范圍內，中間物在325nm波長出有強烈光吸收。當有SOD存在時，由于它能催化O2

-與H+結合生成O2和H2O2，從而阻止了中間有色產物的積累，導致吸光值下降因此，通過測定它們在特定波長下得光吸收變化速率計算出SOD的酶活性。9a

鄰苯三酚───────O2

-

+紅桔酚（自氧化：有色物質積累，吸光值增加）

O2

-+O2

-+2H+────H202+O2

（SOD催化：阻止中間產物積累，吸光值降低）

pH=8.2SOD10a實驗步驟

1．測定鄰苯三酚溶液自氧化速率：取兩支試管按右表加入25℃預熱過的緩沖液,然后加入預熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L

HCl代替鄰苯三酚

），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數一次，測定4min內每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.070（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。試劑空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/L

Tris-HCl2.982.9810mmol/LHCl0.01——50mmol/L鄰苯三酚——0.0111a2.SOD樣液活力測定：樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預熱的待測酶液，在25℃水浴鍋中保溫10min，再加入預熱的鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。試劑空白管（mL）樣品管（mL）pH8.250mmol/LTris-HCl

2.982.9810mmol/LHCl

0.02

——SOD