谷氨酸發(fā)酵的影響因素及控制谷氨酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵

發(fā)酵過(guò)程中，谷氨酸的大量積累不是由于生物合成途徑的特異，而是菌體代謝調(diào)節(jié)控制和細(xì)胞膜通透性的特異調(diào)節(jié)以及發(fā)酵條件的適合。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程可簡(jiǎn)單的分為2個(gè)階段:

第1階段是菌體生長(zhǎng)階段;第2階段是產(chǎn)酸階段,谷氨酸得以大量積累。

相關(guān)知識(shí)點(diǎn)回顧下列關(guān)于谷氨酸產(chǎn)生菌的描述，哪些是正確的？

A：-酮戊二酸氧化能力微弱，B：谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)，C：具有向胞外分泌谷氨酸的能力，D：在菌體生長(zhǎng)期乙醛酸循環(huán)弱，E：在產(chǎn)酸期乙醛酸循環(huán)弱，F(xiàn)：CO2固定能力弱。第二節(jié)影響谷氨酸產(chǎn)量的因素及發(fā)酵條件控制相關(guān)知識(shí)點(diǎn)回顧下列關(guān)于谷氨酸產(chǎn)生菌的描述，哪些是正確的？

A：-酮戊二酸氧化能力微弱，√B：谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)，√C：具有向胞外分泌谷氨酸的能力，√D：在菌體生長(zhǎng)期乙醛酸循環(huán)弱，E：在產(chǎn)酸期乙醛酸循環(huán)弱，√F：CO2固定能力弱。第二節(jié)影響谷氨酸產(chǎn)量的因素及發(fā)酵條件控制乙醛酸循環(huán)的控制α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)在利用生物素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，應(yīng)如何控制培養(yǎng)基中生物素的含量？

A：在發(fā)酵過(guò)程中始終保證生物素過(guò)量，B：在發(fā)酵過(guò)程中始終控制生物素亞適量，C：在菌體生長(zhǎng)期保證生物素充足，在產(chǎn)酸期控制生物素亞適量，D：在菌體生長(zhǎng)期控制生物素亞適量，在產(chǎn)酸期保證生物素充足。在利用生物素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，應(yīng)如何控制培養(yǎng)基中生物素的含量？

A：在發(fā)酵過(guò)程中始終保證生物素過(guò)量，B：在發(fā)酵過(guò)程中始終控制生物素亞適量，C：在菌體生長(zhǎng)期保證生物素充足，在產(chǎn)酸期控制生物素亞適量，√D：在菌體生長(zhǎng)期控制生物素亞適量，在產(chǎn)酸期保證生物素充足。如何封閉乙醛酸循環(huán)呢？

乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶，研究表明，該酶受以下幾個(gè)因素的影響：為醋酸誘導(dǎo)受琥珀酸和葡萄糖阻遏影響因素1：生物素

如何封閉乙醛酸循環(huán)呢？當(dāng)生物素缺乏時(shí)：（1）丙酮酸的有氧氧化就會(huì)減弱(由于生物素對(duì)TCA循環(huán)的促進(jìn)作用)，則：乙酰輔酶A的生成量就會(huì)少，醋酸濃度降低，它的誘導(dǎo)作用降低；（2）VH對(duì)TCA循環(huán)的促進(jìn)作用的降低，使得其中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強(qiáng)；兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失，乙醛酸循環(huán)得到封閉。由以上分析可知，當(dāng)生物素缺乏時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性減弱。當(dāng)生物素豐富時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性必然加強(qiáng)，則乙醛酸循環(huán)正常進(jìn)行，乙醛酸循環(huán)的進(jìn)行，一方面提供了大量的“中間性產(chǎn)物”，另一方面，菌體的能和水平得到提高。前者是菌體增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，后者則是菌體增殖的能量的保證。這樣的結(jié)果是，有利于菌體的增殖和生長(zhǎng)，則谷氨酸的生物合成就會(huì)受到影響，甚至停止，這在生產(chǎn)上，就是通常我們說(shuō)的“只長(zhǎng)菌，不產(chǎn)酸”的現(xiàn)象。

以上分析說(shuō)明，谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，前期，菌體的增殖期，一定量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。影響因素1：生物素

生物素對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響菌體進(jìn)入產(chǎn)物合成期時(shí)，有谷氨酸產(chǎn)生，如果能夠大量的把產(chǎn)物及時(shí)的排泄到細(xì)胞膜外，可以解除谷氨酸對(duì)L-谷氨酸脫氫酶活性的抑制作用，從而使由葡萄糖→谷氨酸的高效率轉(zhuǎn)化，反之，如果……。可見(jiàn)，改善細(xì)胞膜通透性的重要性

如何進(jìn)行呢？影響因素1：生物素

谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是生物素缺陷型，而生物素又是菌體細(xì)胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，可以通過(guò)控制生物素的濃度，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)。生物素對(duì)細(xì)胞膜合成的影響主要是通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)限制了菌體脂肪酸的合成時(shí)，細(xì)胞就會(huì)形成一個(gè)細(xì)胞膜不完整的菌體。生物體內(nèi)脂肪酸的合成途徑如下：生物素對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響其中，將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A的酶是乙酰輔酶A羧化酶，該酶的輔酶是生物素。當(dāng)培養(yǎng)基中生物素的濃度較低時(shí)，細(xì)胞膜的合成就會(huì)受影響。葡萄糖丙酮酸+丙酮酸乙酰輔酶A乙酰輔酶Ａ乙酰輔酶A羧化酶CO2丙二酰輔酶AC4丙二酰輔酶ACO2C6CO2培養(yǎng)基中生物素限量時(shí)，胞內(nèi)AA92%胞外培養(yǎng)基中生物素豐富時(shí)，胞內(nèi)AA12%胞外

控制？？第1階段是菌體生長(zhǎng)階段

保證生物素充足，使菌體快速生長(zhǎng)；第2階段是產(chǎn)酸階段

控制生物素亞適量(5-10μg/L)，使谷氨酸大量積累。

影響因素1：生物素影響因素2：供氧濃度（通氣量）過(guò)量：

NADPH的再氧化能力會(huì)加強(qiáng)，使α-酮戊二酸的還原氨基化受到影響，不利于谷氨酸的生成。供氧不足：

積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于谷氨酸的產(chǎn)生，同時(shí)，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。α-酮戊二酸NADPH

谷氨酸NADPL-谷氨酸脫氫酶控制？？

在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中,通風(fēng)必須適度。在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前期以低通風(fēng)量為宜；發(fā)酵中、后期以高通風(fēng)量為宜。

實(shí)際生產(chǎn)上，以氣體轉(zhuǎn)子流量計(jì)來(lái)檢查通氣量，即以每分鐘單位體積的通氣量表示通風(fēng)強(qiáng)度。另外發(fā)酵罐大小不同，所需攪拌轉(zhuǎn)速與通風(fēng)量也不同。影響因素2：供氧濃度（通風(fēng)量）影響因素3：NH4+濃度（1）影響到發(fā)酵液的pH值，見(jiàn)pH值影響。（2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)：

NH4+過(guò)量：菌體增殖階段會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)酸階段谷氨酸會(huì)受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺；

NH4+不足：不利于-酮戊二酸的還原氨基化，-酮戊二酸積累，引起反饋調(diào)節(jié)影響因素3：NH4+濃度NH4+的供給方式（流加）：（1）液氨（2）0.8%尿素影響因素4：碳源

發(fā)酵液中糖含量與谷氨酸的發(fā)酵有密切的關(guān)系。在一定范圍內(nèi)，谷氨酸的產(chǎn)量隨糖含量的增加而增加，但糖含量過(guò)高，滲透壓過(guò)大，對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率低。發(fā)酵液中還原糖的含量一般應(yīng)控制在10%～13%。氮源是合成菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸和谷氨酸的氨基來(lái)源，大約85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌體。谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般發(fā)酵工業(yè)多得多，一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100:0.2～2.0，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100:15～21。影響因素5：碳氮比

控制？？

在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)正確控制碳氮比。一般在菌體生長(zhǎng)期碳氮比應(yīng)大一些(氮低），在產(chǎn)酸期,碳氮比應(yīng)小些(氮高）。在碳源和氮源的比為3∶1時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌會(huì)大量合成谷氨酸，但當(dāng)碳源和氮源的比為4∶1時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌只生長(zhǎng)而不合成谷氨酸？。影響因素5：碳氮比

谷氨酸發(fā)酵前期(0～12h)是菌體大量繁殖階段，在此階段菌體利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)合成核酸、蛋白質(zhì)等，供菌體繁殖用，而控制這些合成反應(yīng)的最適溫度均在30～32℃。在發(fā)酵中、后期，是谷氨酸大量積累的階段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脫氫酶的最適溫度在32～36℃，故發(fā)酵中、后期適當(dāng)提高罐溫對(duì)積累谷氨酸有利。影響因素6：發(fā)酵溫度

影響因素7：pH值pH值對(duì)谷氨酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的影響

谷氨酸產(chǎn)生菌象其它微生物一樣，有最適生長(zhǎng)pH值范圍，當(dāng)高于或低于這個(gè)值時(shí)：(1)菌體內(nèi)的酶受到抑制，菌體新陳代謝受阻，生長(zhǎng)停滯；(2)菌體細(xì)胞膜所帶電荷發(fā)生改變，從而改變細(xì)胞膜的滲透性，影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和代謝產(chǎn)物的排出；(3)影響培養(yǎng)基組分和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響菌體對(duì)這些物質(zhì)的利用。pH值對(duì)谷氨酸積累的影響谷氨酸脫氫酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最適pH為7.0～7.2，當(dāng)發(fā)酵液的pH值偏酸時(shí)(pH5.0-5.8)，谷氨酸脫氫酶受到抑制，代謝向著生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向進(jìn)行。在發(fā)酵后期由于耗用大量NH4+，pH值下降，此時(shí)就要進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)，以保證發(fā)酵的正常進(jìn)行。影響因素7：pH值pH發(fā)生變化的主要原因是培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的利用和代謝產(chǎn)物的積累。如當(dāng)谷氨酸棒狀桿菌利用糖類物質(zhì)不斷生成谷氨酸時(shí)，培養(yǎng)液的pH就會(huì)下降。而堿性物質(zhì)的消耗和氨的生成等則會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH上升。pH：前期pH（7.5～8.0），中后期pH（7.0～7.6）。通過(guò)采用流加尿素，氨水或液氨等辦法調(diào)節(jié)pH，補(bǔ)充氮源。影響因素7：pH值谷氨酸發(fā)酵是好氣性發(fā)酵，因通風(fēng)和攪拌產(chǎn)生泡沫是正常的，但泡沫過(guò)多會(huì)帶來(lái)一系列問(wèn)題：

(1)泡沫形成泡蓋時(shí)，代謝產(chǎn)生的氣體不能及時(shí)排出，妨礙菌體呼吸作用，影響菌體的正常代謝；(2)泡沫過(guò)多，發(fā)酵液會(huì)外溢，造成浪費(fèi)和污染；(3)泡沫過(guò)多，易沖上罐頂，造成染菌。因此，在谷氨酸的發(fā)酵過(guò)程中控制好過(guò)多的泡沫是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。影響因素8：泡沫在發(fā)酵過(guò)程中由于強(qiáng)烈的通風(fēng)和菌體代謝產(chǎn)生的CO2，使培養(yǎng)液產(chǎn)生大量的泡沫，不僅使氧在發(fā)酵液中的擴(kuò)散受阻，影響菌體的呼吸和代謝。給發(fā)酵帶來(lái)危害，必須加以消泡。消泡方法有機(jī)械消泡(耙式、離心式、刮板式、蝶式消泡器)和化學(xué)消泡(天然油脂、聚酯類、醇類、硅酮等化學(xué)消泡劑)兩種方法。影響因素8：泡沫影響因素9：發(fā)酵時(shí)間的控制不同的谷氨酸產(chǎn)生菌對(duì)糖的濃度要求也不一樣，其發(fā)酵時(shí)間也有所差異。低糖(10%～12%)發(fā)酵，其發(fā)酵時(shí)間為36～38h，中糖(14%)發(fā)酵，其發(fā)酵時(shí)間為45h。

谷氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件與產(chǎn)物的關(guān)系控制因子發(fā)酵產(chǎn)品轉(zhuǎn)換氧氣乳酸或琥珀酸（通氣不足）←→谷氨酸（通氣充足）NH4+α-酮戊二酸（缺乏）←→谷氨酸（適量）←→谷氨酰胺（過(guò)量）pHN-乙酰谷氨酰胺（酸性）←→谷氨酸（中性或微堿性）磷酸纈氨酸（高濃度）←→谷氨酸生物素乳酸或琥珀酸（豐富）←→谷氨酸（缺乏）

谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，生產(chǎn)菌種的特性、生物素、發(fā)酵溫度、pH值、通風(fēng)和發(fā)酵產(chǎn)生的泡沫都是影響谷氨酸積累的主要因素。在實(shí)際生產(chǎn)中，只有針對(duì)存在的問(wèn)題，嚴(yán)格控制工藝條件，才能達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的目的。

發(fā)酵過(guò)程參數(shù)測(cè)定還原糖的測(cè)定谷氨酸的測(cè)定菌體形態(tài)觀察菌體濃度測(cè)定發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的控制DO值pH溫度攪拌速度發(fā)酵發(fā)酵液冷卻接種三角瓶培養(yǎng)固體斜面培養(yǎng)上罐實(shí)消培養(yǎng)基的配制谷氨酸發(fā)酵的工藝流程簡(jiǎn)圖

谷氨酸生產(chǎn)菌

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium

glutamicum)乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium

lactofermenturn)黃色短桿菌(Brevibacterium

flavum)我國(guó)使用的生產(chǎn)菌株：

北京棒桿菌(Corynebacterium

pekinense)AS1.299北京棒桿菌D110

鈍齒棒桿菌(Corynebacterium

crenatum)AS1.542

棒桿菌(Corynebacteriumsp.)S-914黃色短桿菌T6~13

谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)菌株特點(diǎn)

在己報(bào)道的谷氨酸生產(chǎn)菌中，除芽孢桿菌外，雖然它們?cè)诜诸悓W(xué)上屬于不同的屬種，但都有一些共同特點(diǎn):革蘭氏陽(yáng)性菌體為球形、短桿至棒狀不形成芽孢沒(méi)有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)需要生物素作為生長(zhǎng)因子在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。生產(chǎn)原料

發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的原料有淀粉質(zhì)原料：玉米、小麥、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最為常用；大米進(jìn)行浸泡磨漿，再調(diào)成15B