1產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室技術(shù)1產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室技術(shù)2主要內(nèi)容一、產(chǎn)前診斷基本知識(shí)介紹二、產(chǎn)前診斷的取材三、產(chǎn)前診斷主要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)羊水細(xì)胞染體核型分析羊水細(xì)胞熒光原位雜交2主要內(nèi)容一、產(chǎn)前診斷基本知識(shí)介紹3為什么要進(jìn)行產(chǎn)前診斷圍生兒期常見(jiàn)疾病的發(fā)生率大大降低遺傳性疾病的發(fā)生率逐年提高遺傳病不能根治，不少遺傳病病情嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致患兒死亡或終生殘疾產(chǎn)前診斷可及時(shí)診斷遺傳性疾病，有利于積極采取預(yù)防措施，減少遺傳病患兒的出生，降低遺傳性疾病的發(fā)生率3為什么要進(jìn)行產(chǎn)前診斷圍生兒期常見(jiàn)疾病的發(fā)生率大大降低4產(chǎn)前診斷概念產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷，是在胎兒出生前即對(duì)其是否患有某種遺傳性疾病或先天畸形做出準(zhǔn)確判斷產(chǎn)前診斷無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)4產(chǎn)前診斷概念產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷，是在胎兒出生前即對(duì)其是否5產(chǎn)前診斷概念無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)影像學(xué)檢查（X線、超聲、胎兒鏡等），了解胎兒大體形態(tài)的發(fā)育情況母體外周血富集胎兒細(xì)胞技術(shù)母體外周血胎兒游離DNA檢測(cè)有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)（介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)）絨毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、臍帶穿刺術(shù)等有創(chuàng)性操作獲得胎兒細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)分析，判斷胎兒是否患有遺傳性疾病5產(chǎn)前診斷概念無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)6可進(jìn)行產(chǎn)前診斷的疾病有哪些單基因遺傳病:PCR，基因測(cè)序等遺傳病染色體病：染色體核型分析——金標(biāo)準(zhǔn)！熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）多基因遺傳病：疾病易感基因研究基因組病：SNP-array,array-CGH6可進(jìn)行產(chǎn)前診斷的疾病有哪些單基因遺傳病:PCR，基因測(cè)序等67染色體異常的發(fā)生機(jī)率活產(chǎn)嬰兒0.6%先天性智力障礙（MR）患者23%先天性心臟病13%死胎和圍產(chǎn)期死亡胎兒6.0%自然流產(chǎn)(前三個(gè)月)60%7染色體異常的發(fā)生機(jī)率活產(chǎn)嬰兒8染色體異常的發(fā)生機(jī)率21-三體綜合征新生兒發(fā)病率高達(dá)1/80018-三體發(fā)病率約為1/800013-三體發(fā)病率約為1/20000其它各種性染色體異常發(fā)病率約為1/10008染色體異常的發(fā)生機(jī)率21-三體綜合征新生兒發(fā)病率高達(dá)1/89哪些人需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦35歲以上高齡孕婦夫婦任一方為染色體病或染色體平衡易位攜帶者曾生育過(guò)染色體異常患兒的夫婦再次妊娠曾有不明原因自然流產(chǎn)、畸胎、死胎、死產(chǎn)或新生兒死亡史的孕婦再次妊娠采用輔助生殖技術(shù)妊娠者夫婦一方有明顯致畸因素接觸史者9哪些人需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦10孕期胎兒染色體篩查方案10孕期胎兒染色體篩查方案11唐氏篩查報(bào)告的解讀例如：21-三體風(fēng)險(xiǎn)率1/100假陽(yáng)性和假陰性結(jié)合母親年齡的三聯(lián)篩查，唐氏綜合癥檢出率:≈65%，假陽(yáng)性率：4.5-5.0%增加抑制素A，可以將檢出率增加到75%結(jié)合母親年齡的NT測(cè)量，21三體檢出率：77%，假陽(yáng)性率：5%結(jié)合生化分析和頸透明度的唐氏綜合癥的檢測(cè)檢出率可以達(dá)到89%，假陽(yáng)性率：5%僅僅是篩查實(shí)驗(yàn)，不是確診實(shí)驗(yàn)！11唐氏篩查報(bào)告的解讀例如：21-三體風(fēng)險(xiǎn)率1/10012先天愚型的發(fā)生率與母親年齡關(guān)系母親生育年齡（歲）出生先天愚型患兒風(fēng)險(xiǎn)率曾生育過(guò)先天愚型患兒孕婦再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)＜201/1850增加5倍即1/37020-251/1600增加5倍即1/32025-301/1350增加5倍即1/27030-351/800增加5倍即1/16035-401/260無(wú)明顯增加40-451/100無(wú)明顯增加＞451/50無(wú)明顯增加12先天愚型的發(fā)生率與母親年齡關(guān)系母親生育年齡（歲）出生先天13產(chǎn)前診斷取材絨毛膜穿刺術(shù)羊膜腔穿刺臍靜脈穿刺術(shù)13產(chǎn)前診斷取材絨毛膜穿刺術(shù)14絨毛膜穿刺術(shù)在妊娠9-11周之間進(jìn)行一次絨毛活檢獲取20mg左右的絨毛組織可滿足任何產(chǎn)前診斷的需要操作相關(guān)的流產(chǎn)率約為1%14絨毛膜穿刺術(shù)在妊娠9-11周之間進(jìn)行15羊膜腔穿刺術(shù)孕18-24周B超引導(dǎo)下取羊水25-30ml15羊膜腔穿刺術(shù)孕18-24周16臍靜脈穿刺術(shù)操作時(shí)間窗為18周至分娩，妊娠20-24周為最佳穿刺時(shí)期其危險(xiǎn)性高于羊膜腔穿刺術(shù)和CVS16臍靜脈穿刺術(shù)操作時(shí)間窗為18周至分娩，妊娠20-24周為17產(chǎn)前診斷主要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析羊水細(xì)胞熒光原位雜交檢測(cè)（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）17產(chǎn)前診斷主要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析18羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析18羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析19羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理標(biāo)本采集：一般為孕18～24周，此時(shí)羊水中所含成纖維細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞多，較易生長(zhǎng)羊水細(xì)胞是胎兒皮膚等的脫落細(xì)胞，大部分是固縮的，死亡的，只有一小部分是活細(xì)胞人的羊水細(xì)胞能長(zhǎng)成單層貼壁細(xì)胞克隆并可連續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)19羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理標(biāo)本采集：一般為孕18～24周，此20羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)條件：37℃,5%CO2開(kāi)放式培養(yǎng)經(jīng)過(guò)7天左右的培養(yǎng)，羊水細(xì)胞可生長(zhǎng)為較成熟的細(xì)胞克隆，此時(shí)需更換培養(yǎng)液換液后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，在換液后d1天及d2天在倒置顯微鏡下觀察克隆生長(zhǎng)情況，適時(shí)加入秋水仙素終止培養(yǎng)20羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)條件：37℃,5%CO2開(kāi)放式21羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟25ml羊水于1500rpm離心10min小心棄上清后，用1ml羊水重懸沉淀加入5ml完全羊水培養(yǎng)基，混勻轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，擰松瓶蓋，置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7天一般7天后鏡下觀察，可見(jiàn)成纖維樣或上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，在貼壁細(xì)胞層的背景上出現(xiàn)圓形細(xì)胞時(shí)，視情況（有較好的梭形細(xì)胞克隆）可換上完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)如細(xì)胞生長(zhǎng)狀況好，即可加入秋水仙素作用4-6小時(shí)左右行細(xì)胞學(xué)處理。21羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟25ml羊水于1500rpm離心1022細(xì)胞收獲及染色體制備實(shí)驗(yàn)步驟倒出倒出瓶中細(xì)胞上清液入15ml離心管中0.25%EDTA-trypsin消化3-5分鐘，待細(xì)胞面出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)皺形改變時(shí)即用吸管吹打細(xì)胞，加入上清液終止消化收集細(xì)胞懸液：1500rpm離心10min，去上清低滲：加入0.075MKCl6ml，吸管吹打，37℃水浴30min預(yù)固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），輕混勻，1500rpm離心10min固定：去上清，加入固定液8ml，輕混勻，1500rpm離心10min重復(fù)固定一次，1500rpm離心10min，去上清根據(jù)管底細(xì)胞量適當(dāng)加入幾滴新鮮固定液，滴片顯帶、染色，顯微鏡下分析22細(xì)胞收獲及染色體制備實(shí)驗(yàn)步驟倒出倒出瓶中細(xì)胞上清液入1523正常男性染色體核型正常女性染色體核型23正常男性染色體核型正常女性染色體核型2421-三體男性染色體核型21-三體女性染色體核型2421-三體男性染色體核型21-三體女性染色體核25羊水細(xì)胞熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)原理：經(jīng)過(guò)熒光素標(biāo)記的DNA探針，可特異性的與染色體上與之互補(bǔ)的序列相結(jié)合，從而使染色體對(duì)應(yīng)位置上發(fā)出熒光信號(hào)在細(xì)胞學(xué)水平和分子水平之間架起了一道橋梁25羊水細(xì)胞熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)原理：26熒光原位雜交（FISH）技術(shù)用已知的熒光標(biāo)記單鏈核苷酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位26熒光原位雜交（FISH）技術(shù)用已知的熒光標(biāo)記單鏈核苷酸為2627羊水細(xì)胞熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)熒光標(biāo)記的DNA探針27羊水細(xì)胞熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)熒光標(biāo)記的DNA探針28FISH技術(shù)可檢測(cè)哪些染色體病羊水FISH檢測(cè)技術(shù)可快速檢測(cè)羊水細(xì)胞中13、18、21、X、Y染色體數(shù)目異常以上五種染色體非整倍體異常發(fā)生率占所有染色體非整倍體發(fā)生率65%以上，占染色體異常活嬰的95%以上28FISH技術(shù)可檢測(cè)哪些染色體病羊水FISH檢測(cè)技術(shù)可快速29FISH試驗(yàn)流程羊水細(xì)胞處理：低滲、固定、滴片玻片預(yù)處理玻片變性，打開(kāi)DNA雙鏈熒光探針配置探針變性，打開(kāi)DNA雙鏈玻片置于濕盒中42℃恒溫孵育箱中雜交過(guò)夜（14~18小時(shí)）洗片，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)29FISH試驗(yàn)流程羊水細(xì)胞處理：低滲、固定、滴片玻片預(yù)處理30圖1A：正常男性核型圖；

B：13/21組熒光信號(hào)圖，綠色示13號(hào)、紅色示21號(hào)；

C：18/X/Y組熒光信號(hào)圖，藍(lán)色示18號(hào)、綠色示X、紅色示Y核型分析與FISH結(jié)果

圖1A1B1C30圖1A：正常男性核型圖；核型分析與FISH結(jié)果31核型分析與FISH結(jié)果圖2A：正常女性核型圖；

B：13/21組熒光信號(hào)圖，綠色示13號(hào)、紅色示21號(hào)；

C：18/X/Y組熒光信號(hào)圖，藍(lán)色示18號(hào)、綠色示X

圖2A2B2C31核型分析與FISH結(jié)果圖2A：正常女性核型圖；32核型分析與FISH結(jié)果

圖3A3B3C圖3A：21-三體男性核型圖（箭頭示三條21號(hào)染色體）

B：13/21組熒光信號(hào)圖，綠色示13號(hào)、紅色示21號(hào)（3個(gè)）

C：18/X/Y組熒光信號(hào)圖，藍(lán)色示18號(hào)、綠色示X、紅色示Y32核型分析與FISH結(jié)果圖3A33核型分析與FISH技術(shù)對(duì)比核型分析——優(yōu)點(diǎn)可檢出全部46條染色體不僅能檢出染色體數(shù)目異常，還能檢出染色體結(jié)構(gòu)異常目前仍是診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn)核型分析——缺點(diǎn)孕周要求較為嚴(yán)格，一般為18-24周需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，診斷周期長(zhǎng)，核型分析報(bào)告時(shí)間為15-20天可能發(fā)生污染或培養(yǎng)失敗等情況

33核型分析與FISH技術(shù)對(duì)比核型分析——優(yōu)點(diǎn)34FISH技術(shù)——優(yōu)點(diǎn)不經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，縮短了診斷時(shí)間，提高了診斷效率，報(bào)告時(shí)間為2-3天對(duì)孕周無(wú)嚴(yán)格要求操作簡(jiǎn)便、敏感、特異性強(qiáng)FISH技術(shù)——缺點(diǎn)僅能檢出部分染色體數(shù)目異常不能檢出染色體結(jié)構(gòu)重排及變異核型分析與FISH技術(shù)對(duì)比34FISH技術(shù)——優(yōu)點(diǎn)核型分析與FISH技術(shù)對(duì)比侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)的利與弊3547,XY,+21利：目前的金標(biāo)準(zhǔn)弊：

一定的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)：0.5%報(bào)告周期長(zhǎng)，存在培養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)孕婦和家屬承受較大思想壓力侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)的利與弊3547,XY,+21利：目前無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)36無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)36無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)37無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)3738無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)38無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)39無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的利與弊39無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的利與弊產(chǎn)前診斷新技術(shù)高通量基因測(cè)序染色體微陣列（CMA，SNP-array）分辨率高，是普通核型分析的20倍可檢出重復(fù)或缺失序列的來(lái)源不能檢出染色體平衡性結(jié)構(gòu)改變不能檢出重復(fù)或缺失序列在染色體組中的位置產(chǎn)前診斷新技術(shù)高通量基因測(cè)序4041產(chǎn)前診斷的重要性41產(chǎn)前診斷的重要性42本節(jié)知識(shí)回顧產(chǎn)前診斷的概念產(chǎn)前診斷的主要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析羊水細(xì)胞熒光原位雜交42本節(jié)知識(shí)回顧產(chǎn)前診斷的概念43謝謝!!43謝謝!!44產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室技術(shù)1產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室技術(shù)45主要內(nèi)容一、產(chǎn)前診斷基本知識(shí)介紹二、產(chǎn)前診斷的取材三、產(chǎn)前診斷主要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)羊水細(xì)胞染體核型分析羊水細(xì)胞熒光原位雜交2主要內(nèi)容一、產(chǎn)前診斷基本知識(shí)介紹46為什么要進(jìn)行產(chǎn)前診斷圍生兒期常見(jiàn)疾病的發(fā)生率大大降低遺傳性疾病的發(fā)生率逐年提高遺傳病不能根治，不少遺傳病病情嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致患兒死亡或終生殘疾產(chǎn)前診斷可及時(shí)診斷遺傳性疾病，有利于積極采取預(yù)防措施，減少遺傳病患兒的出生，降低遺傳性疾病的發(fā)生率3為什么要進(jìn)行產(chǎn)前診斷圍生兒期常見(jiàn)疾病的發(fā)生率大大降低47產(chǎn)前診斷概念產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷，是在胎兒出生前即對(duì)其是否患有某種遺傳性疾病或先天畸形做出準(zhǔn)確判斷產(chǎn)前診斷無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)4產(chǎn)前診斷概念產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷，是在胎兒出生前即對(duì)其是否48產(chǎn)前診斷概念無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)影像學(xué)檢查（X線、超聲、胎兒鏡等），了解胎兒大體形態(tài)的發(fā)育情況母體外周血富集胎兒細(xì)胞技術(shù)母體外周血胎兒游離DNA檢測(cè)有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)（介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)）絨毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、臍帶穿刺術(shù)等有創(chuàng)性操作獲得胎兒細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)分析，判斷胎兒是否患有遺傳性疾病5產(chǎn)前診斷概念無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)49可進(jìn)行產(chǎn)前診斷的疾病有哪些單基因遺傳病:PCR，基因測(cè)序等遺傳病染色體病：染色體核型分析——金標(biāo)準(zhǔn)！熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）多基因遺傳病：疾病易感基因研究基因組病：SNP-array,array-CGH6可進(jìn)行產(chǎn)前診斷的疾病有哪些單基因遺傳病:PCR，基因測(cè)序等4950染色體異常的發(fā)生機(jī)率活產(chǎn)嬰兒0.6%先天性智力障礙（MR）患者23%先天性心臟病13%死胎和圍產(chǎn)期死亡胎兒6.0%自然流產(chǎn)(前三個(gè)月)60%7染色體異常的發(fā)生機(jī)率活產(chǎn)嬰兒51染色體異常的發(fā)生機(jī)率21-三體綜合征新生兒發(fā)病率高達(dá)1/80018-三體發(fā)病率約為1/800013-三體發(fā)病率約為1/20000其它各種性染色體異常發(fā)病率約為1/10008染色體異常的發(fā)生機(jī)率21-三體綜合征新生兒發(fā)病率高達(dá)1/852哪些人需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦35歲以上高齡孕婦夫婦任一方為染色體病或染色體平衡易位攜帶者曾生育過(guò)染色體異常患兒的夫婦再次妊娠曾有不明原因自然流產(chǎn)、畸胎、死胎、死產(chǎn)或新生兒死亡史的孕婦再次妊娠采用輔助生殖技術(shù)妊娠者夫婦一方有明顯致畸因素接觸史者9哪些人需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦53孕期胎兒染色體篩查方案10孕期胎兒染色體篩查方案54唐氏篩查報(bào)告的解讀例如：21-三體風(fēng)險(xiǎn)率1/100假陽(yáng)性和假陰性結(jié)合母親年齡的三聯(lián)篩查，唐氏綜合癥檢出率:≈65%，假陽(yáng)性率：4.5-5.0%增加抑制素A，可以將檢出率增加到75%結(jié)合母親年齡的NT測(cè)量，21三體檢出率：77%，假陽(yáng)性率：5%結(jié)合生化分析和頸透明度的唐氏綜合癥的檢測(cè)檢出率可以達(dá)到89%，假陽(yáng)性率：5%僅僅是篩查實(shí)驗(yàn)，不是確診實(shí)驗(yàn)！11唐氏篩查報(bào)告的解讀例如：21-三體風(fēng)險(xiǎn)率1/10055先天愚型的發(fā)生率與母親年齡關(guān)系母親生育年齡（歲）出生先天愚型患兒風(fēng)險(xiǎn)率曾生育過(guò)先天愚型患兒孕婦再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)＜201/1850增加5倍即1/37020-251/1600增加5倍即1/32025-301/1350增加5倍即1/27030-351/800增加5倍即1/16035-401/260無(wú)明顯增加40-451/100無(wú)明顯增加＞451/50無(wú)明顯增加12先天愚型的發(fā)生率與母親年齡關(guān)系母親生育年齡（歲）出生先天56產(chǎn)前診斷取材絨毛膜穿刺術(shù)羊膜腔穿刺臍靜脈穿刺術(shù)13產(chǎn)前診斷取材絨毛膜穿刺術(shù)57絨毛膜穿刺術(shù)在妊娠9-11周之間進(jìn)行一次絨毛活檢獲取20mg左右的絨毛組織可滿足任何產(chǎn)前診斷的需要操作相關(guān)的流產(chǎn)率約為1%14絨毛膜穿刺術(shù)在妊娠9-11周之間進(jìn)行58羊膜腔穿刺術(shù)孕18-24周B超引導(dǎo)下取羊水25-30ml15羊膜腔穿刺術(shù)孕18-24周59臍靜脈穿刺術(shù)操作時(shí)間窗為18周至分娩，妊娠20-24周為最佳穿刺時(shí)期其危險(xiǎn)性高于羊膜腔穿刺術(shù)和CVS16臍靜脈穿刺術(shù)操作時(shí)間窗為18周至分娩，妊娠20-24周為60產(chǎn)前診斷主要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析羊水細(xì)胞熒光原位雜交檢測(cè)（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）17產(chǎn)前診斷主要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析61羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析18羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析62羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理標(biāo)本采集：一般為孕18～24周，此時(shí)羊水中所含成纖維細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞多，較易生長(zhǎng)羊水細(xì)胞是胎兒皮膚等的脫落細(xì)胞，大部分是固縮的，死亡的，只有一小部分是活細(xì)胞人的羊水細(xì)胞能長(zhǎng)成單層貼壁細(xì)胞克隆并可連續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)19羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理標(biāo)本采集：一般為孕18～24周，此63羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)條件：37℃,5%CO2開(kāi)放式培養(yǎng)經(jīng)過(guò)7天左右的培養(yǎng)，羊水細(xì)胞可生長(zhǎng)為較成熟的細(xì)胞克隆，此時(shí)需更換培養(yǎng)液換液后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，在換液后d1天及d2天在倒置顯微鏡下觀察克隆生長(zhǎng)情況，適時(shí)加入秋水仙素終止培養(yǎng)20羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)條件：37℃,5%CO2開(kāi)放式64羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟25ml羊水于1500rpm離心10min小心棄上清后，用1ml羊水重懸沉淀加入5ml完全羊水培養(yǎng)基，混勻轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，擰松瓶蓋，置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7天一般7天后鏡下觀察，可見(jiàn)成纖維樣或上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，在貼壁細(xì)胞層的背景上出現(xiàn)圓形細(xì)胞時(shí)，視情況（有較好的梭形細(xì)胞克隆）可換上完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)如細(xì)胞生長(zhǎng)狀況好，即可加入秋水仙素作用4-6小時(shí)左右行細(xì)胞學(xué)處理。21羊水細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟25ml羊水于1500rpm離心1065細(xì)胞收獲及染色體制備實(shí)驗(yàn)步驟倒出倒出瓶中細(xì)胞上清液入15ml離心管中0.25%EDTA-trypsin消化3-5分鐘，待細(xì)胞面出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)皺形改變時(shí)即用吸管吹打細(xì)胞，加入上清液終止消化收集細(xì)胞懸液：1500rpm離心10min，去上清低滲：加入0.075MKCl6ml，吸管吹打，37℃水浴30min預(yù)固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），輕混勻，1500rpm離心10min固定：去上清，加入固定液8ml，輕混勻，1500rpm離心10min重復(fù)固定一次，1500rpm離心10min，去上清根據(jù)管底細(xì)胞量適當(dāng)加入幾滴新鮮固定液，滴片顯帶、染色，顯微鏡下分析22細(xì)胞收獲及染色體制備實(shí)驗(yàn)步驟倒出倒出瓶中細(xì)胞上清液入1566正常男性染色體核型正常女性染色體核型23正常男性染色體核型正常女性染色體核型6721-三體男性染色體核型21-三體女性染色體核型2421-三體男性染色體核型21-三體女性染色體核68羊水細(xì)胞熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)原理：經(jīng)過(guò)熒光素標(biāo)記的DNA探針，可特異性的與染色體上與之互補(bǔ)的序列相結(jié)合，從而使染色體對(duì)應(yīng)位置上發(fā)出熒光信號(hào)在細(xì)胞學(xué)水平和分子水平之間架起了一道橋梁25羊水細(xì)胞熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)原理：69熒光原位雜交（FISH）技術(shù)用已知的熒光標(biāo)記單鏈核苷酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位26熒光原位雜交（FISH）技術(shù)用已知的熒光標(biāo)記單鏈核苷酸為6970羊水細(xì)胞熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)熒光標(biāo)記的DNA探針27羊水細(xì)胞熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)熒光標(biāo)記的DNA探針71FISH技術(shù)可檢測(cè)哪些染色體病羊水FISH檢測(cè)技術(shù)可快速檢測(cè)羊水細(xì)胞中13、18、21、X、Y染色體數(shù)目異常以上五種染色體非整倍體異常發(fā)生率占所有染色體非整倍體發(fā)生率65%以上，占染色體異常活嬰的95%以上28FISH技術(shù)可檢測(cè)哪些染色體病羊水FISH檢測(cè)技術(shù)可快速72FISH試驗(yàn)流程羊水細(xì)胞處理：低滲、固定、滴片玻片預(yù)處理玻片變性，打開(kāi)DNA雙鏈熒光探針配置探針變性，打開(kāi)DNA雙鏈玻片置于濕盒中42℃恒溫孵育箱中雜交過(guò)夜（14~18小時(shí)）洗片，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)29FISH試驗(yàn)流程羊水細(xì)胞處理：低滲、固定、滴片玻片預(yù)處理73圖1A：正常男性核型圖；

B：13/21組熒光信號(hào)圖，綠色示13號(hào)、紅色示21號(hào)；

C：18/X/Y組熒光信號(hào)圖，藍(lán)色示18號(hào)、綠色示X、紅色示Y核型分析與FISH結(jié)果

圖1A1B1C30圖1A：正常男性核型圖；核型分析與FISH結(jié)果74核型分析與FISH結(jié)果圖2A：正常女性核型圖；

B：13/21組熒光信號(hào)圖，綠色示13號(hào)、紅色示21號(hào)；

C：18/X/Y組熒光信號(hào)圖，藍(lán)色示18號(hào)、綠色示X

圖2A2B