第二部分

高效液相色譜儀及簡單操作維護(hù)

第二部分

高效液相色譜儀及簡單操作維護(hù)1HPLC技術(shù)的發(fā)展過程HPLC是經(jīng)典液相色譜的發(fā)展，同時(shí)是氣相色譜理論的擴(kuò)展和延伸。二十世紀(jì)60年代末期生產(chǎn)出商品化液相色譜儀，其發(fā)展非常快速，經(jīng)過30多年的努力已成為分離學(xué)科中的骨干技術(shù)。目前，HPLC技術(shù)已趨于成熟。特點(diǎn)：采用高壓泵、高效填料、高靈敏度檢測器實(shí)現(xiàn)了快速、高效和操作自動(dòng)化。HPLC技術(shù)的發(fā)展過程HPLC是經(jīng)典液相色譜的發(fā)展，同時(shí)是氣2HPLC和經(jīng)典液相色譜法的比較

高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱柱長/cm10～2510～200色譜柱柱內(nèi)徑/mm2～10（不銹鋼管）10～50（玻璃管）固定相粒度（粒徑μm）3～5075～600流動(dòng)相流動(dòng)方式

高壓輸液泵壓入

靠重力流入

溶液的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度

快

緩慢

色譜柱入口壓力/MPa2～200.001～0.1色譜柱柱效/（理論塔板數(shù)/m）2*103～5*1042～50進(jìn)樣量/（g）10-6～10-21～10分析時(shí)間/h0.05～1.01～20HPLC和經(jīng)典液相色譜法的比較

高效液相色譜法經(jīng)典液相3高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）分離效能高：柱效可達(dá)5000~30000塊/米（2）選擇性高：通過流動(dòng)相的控制來改善分離過程的選擇性（3）檢測靈敏度高：UV—最小檢出量可以達(dá)到10-9g

FD--最小檢出量可以達(dá)到10-12g（4）分析速度快:采用了高壓泵高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）分離效能高：柱效可達(dá)5000~304高效液相色譜儀課件5流動(dòng)相和儲(chǔ)液罐（1）儲(chǔ)液罐

材質(zhì)：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK）

棕色玻璃瓶會(huì)避免藻類的生長

容積：0.5~2.0L

放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓差

注意：密封、過濾

流動(dòng)相和儲(chǔ)液罐（1）儲(chǔ)液罐6（2）流動(dòng)相----使用限制避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑：

堿金屬鹵化物及其酸溶液，如：碘化鋰、氯化鉀等

高濃度無機(jī)酸，如硝酸、硫酸.

可能含有過氧化物的色譜純醚(如THF、二氧六環(huán)、二丙基乙醚)

在使用前必須用干燥氧化鋁過濾除去過氧化物

含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液，如EDTA，乙二胺四乙酸

四氯化碳與2-異丙醇或四氫呋喃的混合液（2）流動(dòng)相----使用限制避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑：7（2）流動(dòng)相----過濾流動(dòng)相過濾的目的

過濾去除可能存在的微小固體顆粒

保護(hù)色譜高壓泵和色譜柱流動(dòng)相過濾方法

在線溶劑過濾抽真空過濾（2）流動(dòng)相----過濾流動(dòng)相過濾的目的8流動(dòng)相在線過濾：

清潔方法：1、用水沖洗殘留溶劑后，將過濾器放在約35％濃硝酸里浸一小時(shí)2、用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器3、將過濾器重新裝好。4、定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶（每1～3個(gè)月至少清洗一次）不能用超聲波清洗流動(dòng)相在線過濾：清潔方法：不能用超聲波清9流動(dòng)相抽真空過濾過濾用膜：水系和有機(jī)，孔徑：0.22μm和0.45μm流動(dòng)相抽真空過濾過濾用膜：水系和有機(jī)，10流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化（2）流動(dòng)相----脫氣流動(dòng)相脫氣的目的（2）流動(dòng)相----脫氣11常用的脫氣方法有：抽真空脫氣法：特點(diǎn)：可以一次完成過濾和脫氣任務(wù)注意：抽真空會(huì)引起混合溶劑組分的變化，適合單一溶劑體系超聲波脫氣法簡單，但效果不理想常用的脫氣方法有：12常用的脫氣方法（續(xù)）在線真空脫氣法

常用的脫氣方法（續(xù)）在線真空脫氣法13流動(dòng)相的要求：(1)使用新鮮配制的流動(dòng)相，特別是水溶劑或鹽緩沖液建議不超過兩天，最好每天更換流動(dòng)相：water/methanol/trifluoroaceticacid(50/50/0.1)a:freshb:afterthreehoursc:aftereighthours流動(dòng)相的要求：(1)使用新鮮配制的流動(dòng)相，特別是水溶劑或鹽緩14流動(dòng)相的要求：(2)互溶性流動(dòng)相的要求：15流動(dòng)相的要求：(3)紫外吸收流動(dòng)相的要求：16高效液相色譜儀課件17高效液相色譜儀課件18高效液相色譜儀課件19甲醇和水@210nm甲醇和水@254nm乙腈和水@210nm乙腈和水@254nm甲醇和水@210nm甲醇和水@254nm乙腈和水@210nm20流動(dòng)相的要求：

(4)pH的影響流動(dòng)相的要求：

(4)pH的影響21高壓輸液泵和梯度洗脫裝置性能：①泵體材料耐化學(xué)腐蝕②能在高壓下連續(xù)工作③輸液流量范圍寬對(duì)填充柱：分析型輸出流量為0.1~10ml/min制備型輸出流量為1~100ml/min對(duì)微孔柱：分析型輸出流量為10~1000μl/min制備型輸出流量為1~9900μl/min④輸出流量穩(wěn)定、重復(fù)性高流量控制的精密度應(yīng)小于1%（最好為0.5%），重復(fù)性最好為0.5%高壓輸液泵和梯度洗脫裝置性能：①泵體材料耐化學(xué)腐蝕22高壓泵的分類高壓泵的分類23往復(fù)型泵

目前使用的是雙柱塞往復(fù)式并聯(lián)泵和雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵往復(fù)型泵24高效液相色譜儀課件25雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵示意圖雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵示意圖26輸液系統(tǒng)的輔助設(shè)備

主要有管道過濾器、脈動(dòng)阻尼器、由壓力傳感器組成的壓力測量、顯示裝置，以及流動(dòng)相流量的測量裝置輸液系統(tǒng)的輔助設(shè)備27梯度洗脫裝置

梯度洗脫技術(shù)可以提高柱效、縮短分析時(shí)間，改善檢測器的靈敏度，它類似于GC種使用的程序升溫技術(shù)

影響梯度洗脫的主要因素有：溶劑的純度、溶劑的互溶性、檢測器的種類

梯度洗脫裝置

梯度洗脫技術(shù)可以提高柱效、縮短分析時(shí)間28四元低壓梯度系統(tǒng)四元低壓梯度系統(tǒng)29高效液相色譜儀課件30四元高壓梯度系統(tǒng)四元高壓梯度系統(tǒng)31

泵操作注意事項(xiàng)設(shè)定泵運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)的高、低壓極限2.

緩沖鹽溶液與有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)換時(shí)必須用去離子水清洗泵3.

緩沖鹽溶液的濃度不能過高，pH范圍1～13，Cl-的濃度小于0.1mol/L4.清洗柱塞

泵操作注意事項(xiàng)設(shè)定泵運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)的高、低壓極限32注意事項(xiàng)：

1、必須設(shè)定高、低壓極限

2、

緩沖溶液與有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)換時(shí)用去離子水清洗泵

3、緩沖鹽溶液的濃度不能過高，pH范圍1～13，Cl-的濃度小于0.1mol/L；

注意事項(xiàng)：

1、必須設(shè)定高、低壓極限

2、緩沖溶液與有機(jī)33

經(jīng)常使用，每周至少更換一～二次（95%的水）很少使用則每次使用前必須更換經(jīng)常使用，每周至少更換一～二次（95%的水）34泵壓力不正常的主要原因：

氣泡，主動(dòng)閥故障，出口閥故障，密封墊或柱塞桿磨損，滲漏或堵塞，比

例閥故障，傳感器故障，使用比例閥混合時(shí)鹽濃度太高

泵壓力不正常的主要原因：

35進(jìn)樣裝置六通閥進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置六通閥進(jìn)樣裝置36六通閥進(jìn)樣裝置正面六通閥進(jìn)樣裝置正面37六通閥進(jìn)樣裝置反面連接六通閥進(jìn)樣裝置反面連接387725i型六通閥的特點(diǎn)旋轉(zhuǎn)操作時(shí)不中斷流速可部分充滿（可變），也可全部充滿(固定)loop孔角度較寬，改善了操作的容易程度進(jìn)樣從1mL到5ml內(nèi)部有進(jìn)樣信號(hào)線（7725i）;容易使用，可靠高效液相色譜儀課件39高效液相色譜儀課件40高效液相色譜儀課件41一定不能使用尖針！它會(huì)嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈進(jìn)樣針一定不能使用尖針！它會(huì)嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈進(jìn)樣針42進(jìn)完樣后及時(shí)沖洗進(jìn)樣器，特別是用鹽或緩沖液作流動(dòng)相

（由于這些溶液會(huì)形成結(jié)晶從而磨損墊圈）進(jìn)完樣后及時(shí)沖洗進(jìn)樣器，特別是用鹽或緩沖液作流動(dòng)相

（由43沖洗方法：

A.將進(jìn)樣器轉(zhuǎn)至Inject和Load位置，利用液相泵輸送高純水沖洗

(這時(shí)是沖洗樣品環(huán)及溝槽）.

B.用閥清洗接頭和注射器沖洗。

沖洗方法：

A.將進(jìn)樣器轉(zhuǎn)至Inject和Load位置，利44如何判斷手動(dòng)進(jìn)樣器的密封圈漏？

從進(jìn)樣器觀察：進(jìn)樣后將針拔出，若從進(jìn)樣口或排空管有液體冒出，顯示密封圈磨損

從結(jié)果看：通常有壓力不穩(wěn)定，峰面積或保留時(shí)間不穩(wěn)定和殘留嚴(yán)重如何判斷手動(dòng)進(jìn)樣器的密封圈漏？

從進(jìn)樣器觀察：45進(jìn)樣裝置自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶置于進(jìn)樣針下方進(jìn)樣裝置自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶置于進(jìn)樣針下方46進(jìn)樣針穿過墊圈進(jìn)入瓶中進(jìn)樣針穿過墊圈進(jìn)入瓶中47注射器抽取所設(shè)定的樣品體積注射器抽取所設(shè)定的樣品體積48進(jìn)樣針收回進(jìn)樣針收回49轉(zhuǎn)入針端口使之并成為流路的一部分轉(zhuǎn)入針端口使之并成為流路的一部分50色譜柱柱材料和規(guī)格﹠不銹鋼管﹠柱管的內(nèi)徑：0.5～4.6mm﹠填料粒度：3～10μm﹠柱長度：10～25

cm色譜柱柱材料和規(guī)格51色譜柱與儀器的聯(lián)接不同公司的色譜柱接頭不同。處理不當(dāng)時(shí),會(huì)造成：色譜峰展寬(死體積)、柱效下降或滲漏

色譜柱與儀器的聯(lián)接不同公司的色譜柱接頭不同。處理不當(dāng)時(shí),會(huì)52

錐箍錐度不合適造成滲漏長度不合適造成柱前死體積錐箍錐度不合適造成滲漏長度不合適造成柱前死體積53

自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭

使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）

錐箍在管上是活動(dòng)的，即stop-depth的長度可調(diào)，能換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。如PEEK工程塑料的接頭自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭錐箍在管上是活動(dòng)的，即stop-54高效液相色譜儀課件55色譜柱色譜性能的評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)內(nèi)容：分離效能、對(duì)指定溶質(zhì)的選擇型、在不同PH介質(zhì)中的穩(wěn)定性、不同批次但同型號(hào)填料間性能的重現(xiàn)性、適宜的操作壓力等。性能評(píng)價(jià)方法：以指定的一組標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)為樣品，測定它們在柱子上的理論塔板數(shù)，作為柱效的衡量指標(biāo)。例：對(duì)于反相色譜填料，可以選擇一組具有不同極性的芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等作為基本組分，再加以苯酚或苯胺等酸、堿性溶質(zhì)。色譜柱色譜性能的評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)內(nèi)容：分離效能、對(duì)指定溶質(zhì)的選擇型、56測柱效-良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測柱效保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄色譜測試條件

定期檢測柱效

定期檢測儀器的譜帶展寬測柱效-良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測柱效57測柱效的方法色譜柱種類繁多,性能各異,測定方法亦各不相同各色譜柱均附有說明書,可按說明書所述方法測定例：Waters反相C18柱的測定方法

流動(dòng)相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min

樣品:50mgAcenaphthene(二氫苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮進(jìn)樣量5μl

檢測波長:254nm測柱效的方法色譜柱種類繁多,性能各異,測定方法亦各不相同58計(jì)算色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：Wσ方法Wtan16切線法Wh5.54半峰高W3σ

93σW4σ

164σW5σ

255σ

不好的色譜柱的柱效反而比好色譜柱的要高，因?yàn)槠渫衔膊糠譁y不出來計(jì)算色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：不好的色譜柱的柱59柱效低--柱外因素系統(tǒng)連接問題：連接不好造成死體積

進(jìn)樣器檢測器管路，連接口保護(hù)柱在線過濾器堵塞流動(dòng)相問題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！柱效低--柱外因素系統(tǒng)連接問題：連接不好造成死體積“柱效”60色譜柱的正確使用及操作流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換

流速(壓力)的變化幅度

溫度的變化幅度

專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求

記住∶拿到一根從未用過的色譜柱時(shí)一定要先看其使用說明！色譜柱的正確使用及操作流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換61正確使用色譜柱樣品方面

除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用正確使用色譜柱樣品方面62正確使用色譜柱流動(dòng)相方面

除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度

有機(jī)溶劑或水的比例正確使用色譜柱流動(dòng)相方面63反相C18（硅膠基質(zhì)）色譜柱的清洗在流動(dòng)相中添加了一些酸、堿或緩沖鹽進(jìn)行色譜分離后一般的沖洗方法：第一步：用和流動(dòng)相相同比例的水和有機(jī)相沖洗第二步：增大水的比例到90%~95%（最好用梯度）第三步：增大有機(jī)相比例到100%（最好用梯度）最后保存在有機(jī)相（甲醇或乙腈）中記住∶每種色譜柱可能有特定的方法一定要先看其使用說明！反相C18（硅膠基質(zhì)）色譜柱的清洗在流動(dòng)相中添加了一64柱壓高--柱外因素系統(tǒng)反壓問題

阻尼器堵塞進(jìn)樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不干凈保護(hù)柱壓力傳感器不準(zhǔn)確流速是否錯(cuò)誤?柱壓過高，不一定是色譜柱問題！柱壓高--柱外因素系統(tǒng)反壓問題柱壓過高，不一定是色譜柱問題65色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、緩沖鹽合適的存放溶劑

避免色譜柱床的干涸

避免機(jī)械震動(dòng)

防止細(xì)菌生長

注意存放的溫度色譜柱的存放存放前的處理66檢測器主要作用：監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由工作站記錄數(shù)據(jù)，定性、定量分析。

檢測器主要作用：監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由工作67紫外檢測器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長紫外光或可見光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律，紫外檢測器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長紫外光或可見光的選擇68比耳定律光能量∶I0=入射光強(qiáng)度I=透過光強(qiáng)度光通量(透過率%)∶T=I/I0吸光度∶A=-log(T)=log(I0/I)吸光度∶A=abc比耳定律光能量∶69溶劑的影響不同種類溶劑有其截止波長溶劑的質(zhì)量好壞對(duì)其截止波長有影響何為溶劑質(zhì)量不好?含紫外吸收的雜質(zhì)溶解在其中的氧氣緩沖液溶質(zhì)的紫外吸收溶劑的影響不同種類溶劑有其截止波長70背景吸收的影響背景吸收減少線性范圍許多溶劑產(chǎn)生背景吸收背景吸收的影響背景吸收減少線性范圍71影響紫外檢測器靈敏度的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)從比耳定律可看出樣品的種類樣品濃度及進(jìn)樣的體積檢測池的長度所使用的波長，檢測器的

時(shí)間常數(shù)噪音(N)流動(dòng)相所使用的波長，燈的能量檢測器的時(shí)間常數(shù)非檢測器因素-電噪音，泵脈動(dòng)等影響紫外檢測器靈敏度的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)72定波長檢測器紫外檢測器種類可變波長檢測器二極管陣列檢測器定波長檢測器73紫外-可見光檢測器光路示意圖紫外-可見光檢測器光路示意圖74可變波長紫外檢測器﹠

選用氘燈作為光源，在190—600nm范圍內(nèi)可連續(xù)調(diào)節(jié)，選擇不同的波長檢測可變波長紫外檢測器﹠選用氘燈作為光源，在190—600n75光電二極管陣列檢測器（DAD）

光電二極管陣列檢測器（DAD）76DAD檢測器的主要特點(diǎn)

①可以同時(shí)得到多個(gè)波長的色譜圖，可以計(jì)算不同波長處的相對(duì)吸收比②可以在色譜分離同時(shí)，對(duì)色譜峰的指定位置實(shí)時(shí)記錄吸收光譜圖，并得到最大吸收波長③在色譜運(yùn)行期間，可以逐點(diǎn)進(jìn)行光譜掃描，得到時(shí)間—波長—吸收值為坐標(biāo)的三維圖形DAD檢測器的主要特點(diǎn)①可以同時(shí)得到多個(gè)波長的色譜圖，可以77高效液相色譜儀課件78例：山梨酸和苯甲酸部分分離的色譜峰a.山梨酸b.苯甲酸c.混合物例：山梨酸和苯甲酸部分79流通池示意圖流通池示意圖80高效液相色譜儀課件81

檢測器的維護(hù)：

保持清潔，每天用后與色譜柱一起清洗

不定期用強(qiáng)溶劑反向沖洗檢測器（流通池）

使用脫過氣的流動(dòng)相，防止氣泡滯留池內(nèi)

檢測器燈有一定壽命

平衡和清洗色譜柱時(shí)不要開燈，檢測中途不要隨意開、關(guān)燈

檢測器的維護(hù)：

保持清潔，每天用后與色譜柱一起清82基線噪音大可能由那些原因引起泵壓不穩(wěn)：氣泡，色譜柱污染，系統(tǒng)管路污染，流通池污染，燈強(qiáng)度不足：光學(xué)系統(tǒng)老化或污染，參數(shù)設(shè)置不合理基線噪音大可能由那些原因引起83基線噪音可能的原因：﹠流通池臟﹠檢測器燈有問題﹠如果是周期性的，電壓或泵的脈沖﹠溫度對(duì)檢測器的影響﹠氣泡經(jīng)過檢測器Time(min.)基線噪音可能的原因：Time(min.)84基線漂移可能的原因：﹠梯度洗脫﹠溫度不穩(wěn)定(示差檢測器）﹠流動(dòng)相中有污染物﹠柱中的流動(dòng)相沒有平衡﹠體系中有污染物流出基線漂移可能的原因：85鬼峰問題1-流動(dòng)相臟問題2-容器污染問題3-柱子污染20%-100%MeOH沒有進(jìn)樣601530150鬼峰——即使不進(jìn)樣也會(huì)出現(xiàn)的峰鬼峰問題1-流動(dòng)相臟20%-100%MeOH沒86峰型可能原因：﹠柱中有死體積﹠過濾片部分堵塞﹠只有一個(gè)雙峰——組分的共洗脫﹠樣品與溶劑不匹配，溶劑與柱子不匹配雙峰柱塌陷

可能原因：正常峰

雙峰峰型可能原因：雙峰柱塌陷可能原因：正常峰87峰型可能的原因：部分峰拖尾﹠二次保留效應(yīng)——?dú)埩艄璐蓟姆磻?yīng)﹠小峰緊跟在大峰的后面流出所有峰拖尾﹠額外的柱效應(yīng)﹠柱壞/不適當(dāng)?shù)娜軇┅}柱頭有污染﹠金屬﹠不適當(dāng)?shù)臉悠妨客衔卜宸Q對(duì)性>1.2NormalTailingNormalTailing峰型可能的原因：拖尾峰稱對(duì)性>1.2NormalTa88峰型可能的原因﹠在大峰前，有小峰流出﹠柱死體積﹠樣品溶劑不適當(dāng)﹠過濾片部分堵塞﹠柱過載正常峰伸舌峰前伸峰不對(duì)稱性<0.9峰型可能的原因正常峰伸舌峰前伸峰不對(duì)稱性<0.989峰寬*在進(jìn)樣口到柱或柱到檢測器之間，使用細(xì)的短的連接管*保證所有的管路接頭都使用正確*用小體積檢測池*減少進(jìn)樣量或降低樣品濃度柱外體積增加峰寬*在進(jìn)樣口到柱或柱到檢測器之間，使用細(xì)的短的連接管柱外90柱外體積效應(yīng)的影響柱外體積效應(yīng)的影響91色譜工作站色譜工作站的主要功能：（1）自行診斷功能（2）全部操作參數(shù)控制功能（3）智能化數(shù)據(jù)處理和譜圖處理功能（4）進(jìn)行計(jì)量認(rèn)證的功能（5）網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行功能色譜工作站色譜工作站的主要功能：92液相色譜基本操作步驟（1）檢查電源線連接是否正確后打開電源開關(guān)（2）泵體及流路內(nèi)的氣泡排除

（3）正確連接色譜柱

注意流向標(biāo)志，切勿反接液相色譜基本操作步驟（1）檢查電源線連接是否正確后打開電源開93（4）系統(tǒng)平衡第一步：先用甲醇或乙腈沖洗流路約20分鐘，平衡活化色譜柱，并趕走管路中的雜質(zhì)和水分。第二步：平衡色譜柱方法一：若流動(dòng)相為有機(jī)相與水相的混合物，則第一步完成后，按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)有機(jī)相與水相的比例后沖洗流路約30分鐘后，待基線走平后即可進(jìn)樣。方法二：若流相相中含有緩沖鹽溶液、有機(jī)/無機(jī)酸，則第一步完成后，先用95%的去離子水沖洗流路約20分鐘后，再按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例，沖洗流路約30分鐘，待基線走平后即可進(jìn)樣。

（4）系統(tǒng)平衡94（5）色譜柱平衡后，打開檢測器（開燈）基本（6）測定樣品（7）清洗儀器色譜柱及流路清洗：

清洗流路時(shí)，關(guān)閉檢測器的氘燈。使用緩沖鹽的“C”管路必須用去離子水沖洗干凈，不得有緩沖鹽殘留

（5）色譜柱平衡后，打開檢測器（開燈）基本95進(jìn)樣閥清洗A、將進(jìn)樣閥處的扳手反時(shí)針扳到頭后，用平頭醫(yī)用注射器吸幾毫升的50%甲醇，從進(jìn)樣口注入，清洗定量環(huán)和管路。B、將進(jìn)樣閥處的扳手順時(shí)針扳到頭后，用平頭醫(yī)用注射器吸幾毫升的50%甲醇，從進(jìn)樣口注入，清洗管路。進(jìn)樣針清洗

用甲醇、純凈水、甲醇反復(fù)清洗

進(jìn)樣閥清洗96第二部分

高效液相色譜儀及簡單操作維護(hù)

第二部分

高效液相色譜儀及簡單操作維護(hù)97HPLC技術(shù)的發(fā)展過程HPLC是經(jīng)典液相色譜的發(fā)展，同時(shí)是氣相色譜理論的擴(kuò)展和延伸。二十世紀(jì)60年代末期生產(chǎn)出商品化液相色譜儀，其發(fā)展非常快速，經(jīng)過30多年的努力已成為分離學(xué)科中的骨干技術(shù)。目前，HPLC技術(shù)已趨于成熟。特點(diǎn)：采用高壓泵、高效填料、高靈敏度檢測器實(shí)現(xiàn)了快速、高效和操作自動(dòng)化。HPLC技術(shù)的發(fā)展過程HPLC是經(jīng)典液相色譜的發(fā)展，同時(shí)是氣98HPLC和經(jīng)典液相色譜法的比較

高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱柱長/cm10～2510～200色譜柱柱內(nèi)徑/mm2～10（不銹鋼管）10～50（玻璃管）固定相粒度（粒徑μm）3～5075～600流動(dòng)相流動(dòng)方式

高壓輸液泵壓入

靠重力流入

溶液的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度

快

緩慢

色譜柱入口壓力/MPa2～200.001～0.1色譜柱柱效/（理論塔板數(shù)/m）2*103～5*1042～50進(jìn)樣量/（g）10-6～10-21～10分析時(shí)間/h0.05～1.01～20HPLC和經(jīng)典液相色譜法的比較

高效液相色譜法經(jīng)典液相99高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）分離效能高：柱效可達(dá)5000~30000塊/米（2）選擇性高：通過流動(dòng)相的控制來改善分離過程的選擇性（3）檢測靈敏度高：UV—最小檢出量可以達(dá)到10-9g

FD--最小檢出量可以達(dá)到10-12g（4）分析速度快:采用了高壓泵高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）分離效能高：柱效可達(dá)5000~30100高效液相色譜儀課件101流動(dòng)相和儲(chǔ)液罐（1）儲(chǔ)液罐

材質(zhì)：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK）

棕色玻璃瓶會(huì)避免藻類的生長

容積：0.5~2.0L

放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓差

注意：密封、過濾

流動(dòng)相和儲(chǔ)液罐（1）儲(chǔ)液罐102（2）流動(dòng)相----使用限制避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑：

堿金屬鹵化物及其酸溶液，如：碘化鋰、氯化鉀等

高濃度無機(jī)酸，如硝酸、硫酸.

可能含有過氧化物的色譜純醚(如THF、二氧六環(huán)、二丙基乙醚)

在使用前必須用干燥氧化鋁過濾除去過氧化物

含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液，如EDTA，乙二胺四乙酸

四氯化碳與2-異丙醇或四氫呋喃的混合液（2）流動(dòng)相----使用限制避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑：103（2）流動(dòng)相----過濾流動(dòng)相過濾的目的

過濾去除可能存在的微小固體顆粒

保護(hù)色譜高壓泵和色譜柱流動(dòng)相過濾方法

在線溶劑過濾抽真空過濾（2）流動(dòng)相----過濾流動(dòng)相過濾的目的104流動(dòng)相在線過濾：

清潔方法：1、用水沖洗殘留溶劑后，將過濾器放在約35％濃硝酸里浸一小時(shí)2、用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器3、將過濾器重新裝好。4、定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶（每1～3個(gè)月至少清洗一次）不能用超聲波清洗流動(dòng)相在線過濾：清潔方法：不能用超聲波清105流動(dòng)相抽真空過濾過濾用膜：水系和有機(jī)，孔徑：0.22μm和0.45μm流動(dòng)相抽真空過濾過濾用膜：水系和有機(jī)，106流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化（2）流動(dòng)相----脫氣流動(dòng)相脫氣的目的（2）流動(dòng)相----脫氣107常用的脫氣方法有：抽真空脫氣法：特點(diǎn)：可以一次完成過濾和脫氣任務(wù)注意：抽真空會(huì)引起混合溶劑組分的變化，適合單一溶劑體系超聲波脫氣法簡單，但效果不理想常用的脫氣方法有：108常用的脫氣方法（續(xù)）在線真空脫氣法

常用的脫氣方法（續(xù)）在線真空脫氣法109流動(dòng)相的要求：(1)使用新鮮配制的流動(dòng)相，特別是水溶劑或鹽緩沖液建議不超過兩天，最好每天更換流動(dòng)相：water/methanol/trifluoroaceticacid(50/50/0.1)a:freshb:afterthreehoursc:aftereighthours流動(dòng)相的要求：(1)使用新鮮配制的流動(dòng)相，特別是水溶劑或鹽緩110流動(dòng)相的要求：(2)互溶性流動(dòng)相的要求：111流動(dòng)相的要求：(3)紫外吸收流動(dòng)相的要求：112高效液相色譜儀課件113高效液相色譜儀課件114高效液相色譜儀課件115甲醇和水@210nm甲醇和水@254nm乙腈和水@210nm乙腈和水@254nm甲醇和水@210nm甲醇和水@254nm乙腈和水@210nm116流動(dòng)相的要求：

(4)pH的影響流動(dòng)相的要求：

(4)pH的影響117高壓輸液泵和梯度洗脫裝置性能：①泵體材料耐化學(xué)腐蝕②能在高壓下連續(xù)工作③輸液流量范圍寬對(duì)填充柱：分析型輸出流量為0.1~10ml/min制備型輸出流量為1~100ml/min對(duì)微孔柱：分析型輸出流量為10~1000μl/min制備型輸出流量為1~9900μl/min④輸出流量穩(wěn)定、重復(fù)性高流量控制的精密度應(yīng)小于1%（最好為0.5%），重復(fù)性最好為0.5%高壓輸液泵和梯度洗脫裝置性能：①泵體材料耐化學(xué)腐蝕118高壓泵的分類高壓泵的分類119往復(fù)型泵

目前使用的是雙柱塞往復(fù)式并聯(lián)泵和雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵往復(fù)型泵120高效液相色譜儀課件121雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵示意圖雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵示意圖122輸液系統(tǒng)的輔助設(shè)備

主要有管道過濾器、脈動(dòng)阻尼器、由壓力傳感器組成的壓力測量、顯示裝置，以及流動(dòng)相流量的測量裝置輸液系統(tǒng)的輔助設(shè)備123梯度洗脫裝置

梯度洗脫技術(shù)可以提高柱效、縮短分析時(shí)間，改善檢測器的靈敏度，它類似于GC種使用的程序升溫技術(shù)

影響梯度洗脫的主要因素有：溶劑的純度、溶劑的互溶性、檢測器的種類

梯度洗脫裝置

梯度洗脫技術(shù)可以提高柱效、縮短分析時(shí)間124四元低壓梯度系統(tǒng)四元低壓梯度系統(tǒng)125高效液相色譜儀課件126四元高壓梯度系統(tǒng)四元高壓梯度系統(tǒng)127

泵操作注意事項(xiàng)設(shè)定泵運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)的高、低壓極限2.

緩沖鹽溶液與有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)換時(shí)必須用去離子水清洗泵3.

緩沖鹽溶液的濃度不能過高，pH范圍1～13，Cl-的濃度小于0.1mol/L4.清洗柱塞

泵操作注意事項(xiàng)設(shè)定泵運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)的高、低壓極限128注意事項(xiàng)：

1、必須設(shè)定高、低壓極限

2、

緩沖溶液與有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)換時(shí)用去離子水清洗泵

3、緩沖鹽溶液的濃度不能過高，pH范圍1～13，Cl-的濃度小于0.1mol/L；

注意事項(xiàng)：

1、必須設(shè)定高、低壓極限

2、緩沖溶液與有機(jī)129

經(jīng)常使用，每周至少更換一～二次（95%的水）很少使用則每次使用前必須更換經(jīng)常使用，每周至少更換一～二次（95%的水）130泵壓力不正常的主要原因：

氣泡，主動(dòng)閥故障，出口閥故障，密封墊或柱塞桿磨損，滲漏或堵塞，比

例閥故障，傳感器故障，使用比例閥混合時(shí)鹽濃度太高

泵壓力不正常的主要原因：

131進(jìn)樣裝置六通閥進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置六通閥進(jìn)樣裝置132六通閥進(jìn)樣裝置正面六通閥進(jìn)樣裝置正面133六通閥進(jìn)樣裝置反面連接六通閥進(jìn)樣裝置反面連接1347725i型六通閥的特點(diǎn)旋轉(zhuǎn)操作時(shí)不中斷流速可部分充滿（可變），也可全部充滿(固定)loop孔角度較寬，改善了操作的容易程度進(jìn)樣從1mL到5ml內(nèi)部有進(jìn)樣信號(hào)線（7725i）;容易使用，可靠高效液相色譜儀課件135高效液相色譜儀課件136高效液相色譜儀課件137一定不能使用尖針！它會(huì)嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈進(jìn)樣針一定不能使用尖針！它會(huì)嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈進(jìn)樣針138進(jìn)完樣后及時(shí)沖洗進(jìn)樣器，特別是用鹽或緩沖液作流動(dòng)相

（由于這些溶液會(huì)形成結(jié)晶從而磨損墊圈）進(jìn)完樣后及時(shí)沖洗進(jìn)樣器，特別是用鹽或緩沖液作流動(dòng)相

（由139沖洗方法：

A.將進(jìn)樣器轉(zhuǎn)至Inject和Load位置，利用液相泵輸送高純水沖洗

(這時(shí)是沖洗樣品環(huán)及溝槽）.

B.用閥清洗接頭和注射器沖洗。

沖洗方法：

A.將進(jìn)樣器轉(zhuǎn)至Inject和Load位置，利140如何判斷手動(dòng)進(jìn)樣器的密封圈漏？

從進(jìn)樣器觀察：進(jìn)樣后將針拔出，若從進(jìn)樣口或排空管有液體冒出，顯示密封圈磨損

從結(jié)果看：通常有壓力不穩(wěn)定，峰面積或保留時(shí)間不穩(wěn)定和殘留嚴(yán)重如何判斷手動(dòng)進(jìn)樣器的密封圈漏？

從進(jìn)樣器觀察：141進(jìn)樣裝置自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶置于進(jìn)樣針下方進(jìn)樣裝置自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶置于進(jìn)樣針下方142進(jìn)樣針穿過墊圈進(jìn)入瓶中進(jìn)樣針穿過墊圈進(jìn)入瓶中143注射器抽取所設(shè)定的樣品體積注射器抽取所設(shè)定的樣品體積144進(jìn)樣針收回進(jìn)樣針收回145轉(zhuǎn)入針端口使之并成為流路的一部分轉(zhuǎn)入針端口使之并成為流路的一部分146色譜柱柱材料和規(guī)格﹠不銹鋼管﹠柱管的內(nèi)徑：0.5～4.6mm﹠填料粒度：3～10μm﹠柱長度：10～25

cm色譜柱柱材料和規(guī)格147色譜柱與儀器的聯(lián)接不同公司的色譜柱接頭不同。處理不當(dāng)時(shí),會(huì)造成：色譜峰展寬(死體積)、柱效下降或滲漏

色譜柱與儀器的聯(lián)接不同公司的色譜柱接頭不同。處理不當(dāng)時(shí),會(huì)148

錐箍錐度不合適造成滲漏長度不合適造成柱前死體積錐箍錐度不合適造成滲漏長度不合適造成柱前死體積149

自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭

使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）

錐箍在管上是活動(dòng)的，即stop-depth的長度可調(diào)，能換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。如PEEK工程塑料的接頭自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭錐箍在管上是活動(dòng)的，即stop-150高效液相色譜儀課件151色譜柱色譜性能的評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)內(nèi)容：分離效能、對(duì)指定溶質(zhì)的選擇型、在不同PH介質(zhì)中的穩(wěn)定性、不同批次但同型號(hào)填料間性能的重現(xiàn)性、適宜的操作壓力等。性能評(píng)價(jià)方法：以指定的一組標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)為樣品，測定它們在柱子上的理論塔板數(shù)，作為柱效的衡量指標(biāo)。例：對(duì)于反相色譜填料，可以選擇一組具有不同極性的芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等作為基本組分，再加以苯酚或苯胺等酸、堿性溶質(zhì)。色譜柱色譜性能的評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)內(nèi)容：分離效能、對(duì)指定溶質(zhì)的選擇型、152測柱效-良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測柱效保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄色譜測試條件

定期檢測柱效

定期檢測儀器的譜帶展寬測柱效-良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測柱效153測柱效的方法色譜柱種類繁多,性能各異,測定方法亦各不相同各色譜柱均附有說明書,可按說明書所述方法測定例：Waters反相C18柱的測定方法

流動(dòng)相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min

樣品:50mgAcenaphthene(二氫苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮進(jìn)樣量5μl

檢測波長:254nm測柱效的方法色譜柱種類繁多,性能各異,測定方法亦各不相同154計(jì)算色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：Wσ方法Wtan16切線法Wh5.54半峰高W3σ

93σW4σ

164σW5σ

255σ

不好的色譜柱的柱效反而比好色譜柱的要高，因?yàn)槠渫衔膊糠譁y不出來計(jì)算色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：不好的色譜柱的柱155柱效低--柱外因素系統(tǒng)連接問題：連接不好造成死體積

進(jìn)樣器檢測器管路，連接口保護(hù)柱在線過濾器堵塞流動(dòng)相問題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！柱效低--柱外因素系統(tǒng)連接問題：連接不好造成死體積“柱效”156色譜柱的正確使用及操作流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換

流速(壓力)的變化幅度

溫度的變化幅度

專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求

記住∶拿到一根從未用過的色譜柱時(shí)一定要先看其使用說明！色譜柱的正確使用及操作流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換157正確使用色譜柱樣品方面

除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用正確使用色譜柱樣品方面158正確使用色譜柱流動(dòng)相方面

除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度

有機(jī)溶劑或水的比例正確使用色譜柱流動(dòng)相方面159反相C18（硅膠基質(zhì)）色譜柱的清洗在流動(dòng)相中添加了一些酸、堿或緩沖鹽進(jìn)行色譜分離后一般的沖洗方法：第一步：用和流動(dòng)相相同比例的水和有機(jī)相沖洗第二步：增大水的比例到90%~95%（最好用梯度）第三步：增大有機(jī)相比例到100%（最好用梯度）最后保存在有機(jī)相（甲醇或乙腈）中記住∶每種色譜柱可能有特定的方法一定要先看其使用說明！反相C18（硅膠基質(zhì)）色譜柱的清洗在流動(dòng)相中添加了一160柱壓高--柱外因素系統(tǒng)反壓問題

阻尼器堵塞進(jìn)樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不干凈保護(hù)柱壓力傳感器不準(zhǔn)確流速是否錯(cuò)誤?柱壓過高，不一定是色譜柱問題！柱壓高--柱外因素系統(tǒng)反壓問題柱壓過高，不一定是色譜柱問題161色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、緩沖鹽合適的存放溶劑

避免色譜柱床的干涸

避免機(jī)械震動(dòng)

防止細(xì)菌生長

注意存放的溫度色譜柱的存放存放前的處理162檢測器主要作用：監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由工作站記錄數(shù)據(jù)，定性、定量分析。

檢測器主要作用：監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由工作163紫外檢測器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長紫外光或可見光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律，紫外檢測器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長紫外光或可見光的選擇164比耳定律光能量∶I0=入射光強(qiáng)度I=透過光強(qiáng)度光通量(透過率%)∶T=I/I0吸光度∶A=-log(T)=log(I0/I)吸光度∶A=abc比耳定律光能量∶165溶劑的影響不同種類溶劑有其截止波長溶劑的質(zhì)量好壞對(duì)其截止波長有影響何為溶劑質(zhì)量不好?含紫外吸收的雜質(zhì)溶解在其中的氧氣緩沖液溶質(zhì)的紫外吸收溶劑的影響不同種類溶劑有其截止波長166背景吸收的影響背景吸收減少線性范圍許多溶劑產(chǎn)生背景吸收背景吸收的影響背景吸收減少線性范圍167影響紫外檢測器靈敏度的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)從比耳定律可看出樣品的種類樣品濃度及進(jìn)樣的體積檢測池的長度所使用的波長，檢測器的

時(shí)間常數(shù)噪音(N)流動(dòng)相所使用的波長，燈的能量檢測器的時(shí)間常數(shù)非檢測器因素-電噪音，泵脈動(dòng)等影響紫外檢測器靈敏度的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)168定波長檢測器紫外檢測器種類可變波長檢測器二極管陣列檢測器定波長檢測器169紫外-可見光檢測器光路示意圖紫外-可見光檢測器光路示意圖170可變波長紫外檢測器﹠

選用氘燈作為光源，在190—600nm范圍內(nèi)可連續(xù)調(diào)節(jié)，選擇不同的波長檢測可變波長紫外檢測器﹠選用氘燈作為光源，在190—600n171光電二極管陣列檢測器（DAD）

光電二極管陣列檢測器（DAD）172DAD檢測器的主要特點(diǎn)

①可以同時(shí)得到多個(gè)波長的色譜圖，可以計(jì)算不同波長處的相對(duì)吸收比②可以在色譜分離同時(shí)，對(duì)色譜峰的指定位置實(shí)時(shí)記錄吸收光譜圖，并得到最大吸收波長③在色譜運(yùn)行期間，可以逐點(diǎn)進(jìn)行光譜掃描，得到時(shí)間—波長—吸收值為坐標(biāo)的三維圖形DAD檢測器的主要特點(diǎn)①可以同時(shí)得到多個(gè)波長的色譜圖，可以173高效液相色譜儀課件174例：山梨酸和苯甲酸部分分離的色譜峰a.山梨酸b.苯甲酸c.混合物例：山梨酸和苯甲酸部分175流通池示意圖流通池示意圖176高效液相色譜