第十二第十一章固相膜免疫測定

隨著免疫學技術和相關生物化學技術的發展，檢測方法上派生出了多種類型的固相膜免疫快速檢測試驗。該類試驗的最大特點是不需要大型設備，對檢測人員稍加培訓即能掌握操作要求和判定標準。

第一節概述

標記免疫測定放射免疫測定1960’酶免疫測定1970’熒光免疫測定1980’－1990’化學發光免疫測定1990’－膜固相免疫測定1990’－一、免疫測定分類免疫濁度測定Ag+AbAgAb+Ab標記免疫測定

Ag+Ab*AgAb*+Ab*

（B）（F）二、免疫測定原理利用抗原抗體反應檢測標本中微量物質抗原+抗體抗原抗體復合物

Ag+Ab

Ag*Ab三、固相免疫測定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb四、固相膜的特點多孔性

毛細管作用非共價鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡便五、常用的固相膜玻璃纖維素膜尼龍膜聚偏氟乙?。≒VDF）膜硝酸纖維素（NC）膜六、固相膜的技術要求孔徑：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質結合力：吸附力很強，以μg/cm2表示均一性固相NC膜第二節免疫金標記技術

免疫金標記技術(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（goldsolution）。

膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)

（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優質劣質膠體金結合物（Conjugate）膜固相免疫測定的特點第三節膜載體免疫測定的種類與原理優點不足之處簡便，快速敏感度略低，價格略高（與ELISA比）單份測定精密度較差，質控困難保存期長（優質試劑）穩定性較差（普通試劑）可測定物范圍廣（主要為定性試驗）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標志心肌標志濫用藥物固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫層析試驗（immunochromatographyassay,ICA）斑點ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶聯免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

一、免疫滲濾測定(IFA)IFA——雙抗體夾心法測抗原ABIFA——結果判斷

技術要點

1）將反應板平放于實驗臺面上，于小孔內滴加含待測抗原標本1～2滴，待完全滲入，與膜上的抗體反應而結合在膜上。

2）于小孔內滴加膠體金標記抗體試劑1～2滴，待完全滲入，使膠體金標記抗體與結合在膜上抗原反應。

3）于小孔內滴加洗滌液2～3滴，待完全滲入，洗去未結合的膠體金標記抗體。

4）結果觀察在膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點顯示者判為陽性反應，反之則為陰性反應。斑點呈色的深淺相應地提示陽性強度。

二、免疫層析測定（ICA）（二）試驗方法

免疫層析試驗以單克隆雙抗體夾心法為例。ICA試劑條樣品墊結合物墊NC膜吸水墊ICA——雙抗體夾心法測抗原ICA——間接法測抗體ICA結果觀察

陽性陰性無效IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應顏色濃度操作結束顏色不變顏色逐漸加深IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）GIFA技術的發展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測抗體金標記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測（滲濾法）原理圖三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA四、酶聯免疫斑點試驗

——

ELISPOT20世紀80年代，國外的科研工作者根據ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌B細胞和細胞因子分泌T細胞的酶聯免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。ELISPOT檢測原理

細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過CTL公司生產的ELISPOT酶聯斑點分析系統對斑點的分析后得出結果。ELISPOT結果判斷五、免疫印跡法——Westernblot法原理Westernblot——抗原表位可能被破壞而漏檢思考題1.敘述固相膜免疫測定概念。2．膜的種類與特性是什么？3．膜載體免疫測定的種類有哪些？4．斑點金免疫滲濾試驗(DIGFA)的原理是什么？5．免疫層析試驗（ICA）的原理是什么？小結

固相膜免疫