脂肪干細胞春脂肪鮑松額域的鹿/王巖斐自從美國加州大學洛杉磯分校(UniversityofCalifornia,LosAngeles,UCLA)的研究人員在《細胞分子生物學》(MolecularBiologyoftheCell)雜志介紹了這種新型成體干細胞群以后，脂肪干細胞(theadipose-derivedstemcells,ADSCs)逐漸成為普遍應用于干細胞領域中的最受歡迎的干細胞群［1］。由于其自身存在的多向分化潛能，和獲取ADSCs的簡單實用性，ADSCs將成為多能胚胎干細胞(pluripotentEScells)的替代物，無論是在實驗室仍是在臨床應用中。長期以來，對于各類原發的和繼發的軟組織缺損的醫治一直是困擾整形外科醫生的難題之一。引發軟組織缺損的原因有嚴重燒傷、感染、體表腫瘤切除術后、各類外傷和先本性疾病等［2］。自體脂肪作為一種軟組織填充物，由于其諸多的并發癥曾一度被人們放棄，但隨著組織工程技術及細胞生物學的發展，自體脂肪移植又逐漸被人們認可?，F將脂肪干細胞在脂肪移植中的作用及其臨床應用現狀綜述如下。1脂肪移植的發展概況20世紀初，自體脂肪顆粒作為一種軟組織填充材料開始應用于臨床。但是，由于其吸收率高、存活率低，且并發癥較多，限制了其在臨床中的普遍應用［3］。21世紀初，通過改良脂肪獲取技術，加速了脂肪血管化，提高了脂肪顆粒移植的成活率。可是，壞死、吸收仍然是顆粒脂肪移植的主要并發癥。直到Zuk等［1］第一次從自體脂肪組織中分離取得具有多向分化潛能的細胞一一ADSCs，脂肪移植的研究愈來愈深切，原因就是ADSCs來源豐碩，取材方便，且組織中干細胞含量豐碩（ADSCs在皮下白色脂肪組織中約占細胞總量的10%-20%［4］），不會引發倫理學爭議等。最近幾年來，隨著組織工程技術的迅速發展，為克服常規注射顆粒脂肪移植的問題，如吸收、囊腫、硬結等，Yoshimura等［5］又發明了細胞輔助的脂肪移植術（cell-assistedlipotransfer,CAL），該技術是將ADSCs與脂肪細胞混合，聯合注射移植。2脂肪來源干細胞（ADSCs）與脂肪移植概述人類的脂肪組織主要由成熟脂肪細胞組成，大約占90%；另外，在間質中還有前脂肪細胞、成纖維細胞、光滑肌細胞和內皮細胞［2］。除此之外，從人的脂肪組織中還可以分離出類似于骨髓間充質干細胞（BMSCs）的細胞群——脂肪來源干細胞（ADSCs），擁有多向分化潛能。ADSCs也屬于來自中胚層的成體干細胞，其體外擴增和自我更新能力很強，通過誘導培育可分化為脂肪細胞、骨和軟骨細胞、肌肉細胞、神經細胞、血管內皮細胞等等。人體內存在棕色和白色兩種脂肪。研究發現，多向分化潛能的干細胞在鼠的白色脂肪組織中很豐碩，而在棕色脂肪組織中它們的含量就相對少了很多［6］。目前，在人體內哪一種脂肪組織可以作為最好的干細胞來源尚無定論。將ADSCs放在脂肪誘導培育基中，可以表達脂蛋白脂肪酶，aP2,PPAR（gamma）2和Glut4等脂肪細胞相關基因E。在體內，ADSCs的成脂能力已取得證明。有研究［8］將ADSCs與海綿狀膠原復合后植入免疫缺點小鼠體內，形成了脂肪樣組織。但是,脂肪組織本身就有大量脂肪前體細胞，且脂肪細胞本身也具有增殖能力，因此，下一步研究應進一步明確該脂肪樣組織的細胞來源問題［9］。ADSCs在脂肪移植中的作用脂肪移植后脂肪組織的存活與萎縮的機制并未取得證明。無微血管存在的脂肪組織在移植后處于相對缺血區，最初幾天的營養灌注來自宿主組織周圍組織，直到形成新的微血管。對于損傷的反映，在組織修復進程中，脂肪細胞（對缺氧很敏感）在氧壓低于其閾值的情況下，24h內可能死亡?？墒?，ADSCs更能耐受缺氧，其在缺氧的情況下可維持功能72血0］。在動物模型的缺血再灌注損傷的脂肪組織中，ADSCs在脂肪移植的修復進程中及在脂肪化和血管化中起著重要的作用［11］，其可調節周圍組織中生長激素及細胞因子的釋放［12］，并通過分泌各類生長因子如VEGF（血管內皮生長因子）、IGF-1（胰島素樣生長因子）避免細胞凋亡［13］，使脂肪組織的再生和凋亡達到平衡。ADSCs存在于脂肪細胞之間、血管壁、結締組織中，但大部份聚集在血管周圍。其在缺氧條件下可釋放血管形成因子［14-15］，并可分化為血管內皮細胞［16］，表現為成血管特性，成為醫治局部缺血性疾病血管發生的最理想細胞來源。最近發現大鼠的脂肪祖細胞像血管管壁細胞一樣存在于脂肪組織的血管中［17］，因此，ADSCs被以為是一種脂肪細胞和血管細胞的雙重祖細胞。這樣，當脂肪組織細胞凋亡后，ADSCs可提供新的脂肪原始細胞；同時，隨著脂肪組織的老齡化、缺血或損傷，ADSCs還可影響微血管的重塑。咱們有理由相信，有功能的ADSCs的數量在組織修復和塑形中具有重要作用。ADSCs在細胞輔助的脂肪移植術（CAL）中的作用CAL技術是將新抽取的脂肪分為兩份:一份用來提取SVF（自體脂肪干細胞，Stromalvascularfractioncells）,另一份作為提取的細胞外基質，兩部份聯合注射于受區［18］0Sterodimas［19］指出，通過吸脂方式獲取的脂肪組織與完整的脂肪組織相較，ADSCs的數量只有原來的一半。其原因可能是一部份ADSCs停留于大血管周圍或留在受體組織中，一部份ADSCs釋放入吸脂脂肪的液體成份中［18］。這種低ADSCs比率可能是移植的脂肪組織長時間后萎縮的主要原因。最近的研究表明，脂肪來源干細胞輔助醫治可提高存活脂肪的體積和質地。在CAL中，脂肪組織可作為有活力的生物支架，使新鮮的包括有ADSCs的SVF粘附在脂肪組織上，不僅增加了前體細胞的數量，還有利于組織血管的形成和ADSCs向脂肪組織的轉歸，提高了脂肪組織的成活率。Yoshimura［20］以為，ADSCs在CAL中的作用可能是：①分化成脂肪細胞并增進脂肪再生；②分化成血管內皮細胞和壁細胞，以增進血管化作用；③在缺氧、損傷等條件下可增進血管生長因子釋放，如肝細胞生長因子（HGF）、基質細胞衍生因子-1（SDF-1）；④最有可能的就是ADSCs作為原始的ADSCs而成活。3脂肪來源干細胞（ADSCs）的分離、培育和鑒定ADSCs的分離和培育分離ADSCs的脂肪組織主要來源于抽脂術后廢棄和切取的脂肪組織。良好的分離技術可取得更多數量的ADSCs，保證ADSCs的活性功能和維持其多向分化潛能。脂肪組織供體的不同可能也影響分離的ADSCs活性。一般以為，ADSCs的附著和增殖能力隨供體年齡增加而降低。但Aust等［21］以為，ADSCs的衰老與供體的體質指數呈負相關，而與年齡無關。由于不同部位脂肪組織的生物代謝特點不同，來源于不同部位的ADSCs數量和分化潛能可能不同。Schipper等［22］發現，與腹部、大腿和乳房來源的脂肪組織相較，人前臂脂肪組織中含有更多的ADSCs。有研究還發現，不同脂肪組織中的ADSCs含量不同。ADSCs在鼠白色脂肪組織中的含量明顯高于棕色脂肪組織。Zuk等四第一次從人脂肪抽吸物中分離出ADSCs，其方式簡述如下：首先將脂肪抽吸物用生理鹽水反復沖洗，加％。膠原酶，37°C消化1h,1200r/min離心10min，棄上清，取細胞沉淀加入DMEM培育液（含10%FBS）。細胞計數，每100mm2培育皿接種1X106個細胞，37C、5%CO2>100%飽和濕度條件下培育。24h后第一次換液，以后每周換液兩次，細胞融合達80%時傳代，細胞以2X104/cm2接種于新的培育皿內。初分離的細胞接種4h后開始貼壁，24h?48h細胞形態呈小圓形，色深。48h后細胞呈梭形，生長有方向性。5?6d后細胞呈集落樣生長，有克隆形成。傳代后細胞仍呈成纖維細胞樣生長，經多次傳代，細胞增殖速度無減慢，這表明ADSCs體外擴增能力強，易于傳代培育。Kurita等［24］研究不同的離心力對分離ADSCs的影響，發現過度離心會破壞脂肪細胞和ADSCs,1200g為最佳離心力，能取得最大量的ADSCs。Matsumoto等［25］研究發現，人脂肪吸取物在4C下留宿保留，不會影響ADSCs的數量和生物活性。有研究者將ADSCs凍存后蘇醒，發現其擴增和分化能力未丟失，形成的脂肪組織與新鮮分離的ADSCs形成的一樣。這使得成立脂肪來源干細胞庫成為可能，為ADSCs的應用提供了廣漠的前景。ADSCs的表型與鑒定目前尚未發現ADSCs的特異細胞標記物。脂肪來源干細胞在形態上與骨髓間充質干細胞相似，無法從形態學上將二者區分。流式細胞儀分析顯示，ADSCs和BMSCs的表面抗原表達大體相同，均表達CD13、CD2九、CD44、CD105,均不表達CD3一、CD34、CD4五、HLA2DR。但二者也存有不同。ADSCs為CD49d（+）、CD106（-），而BMSCs正好相反，CD49d（-）、CD106（+）網。將脂肪抽吸物按前述方式消化離心后，所得沉淀稱為間質血管碎片（stromalvascularfraction,SVF）O在新鮮分離的SVF中，包括以下幾種細胞群：血液來源的細胞（CD45+）、ADSCs（CD31-、CD34+、CD45-、CD90+、CD105-、CD146+）、內皮細胞（CD31+、CD34+、CD45-、CD90+、CD146+）、周細胞（CD31-、CD34-、CD45-、CD90+、CD105-、CD146+）和其他細胞四。有學者觀察了ADSCs隨著培育傳代其免疫表型的轉變，發現間充質細胞相關標記（CD13、CD2九、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166）在初分離的SVF中含量很低，隨著傳代次數增加而迅速升高［28］。干細胞相關標記CD34，在整個培育和傳代進程中都有表達，但在SVF和傳代初期的ADSCs中最高。內皮細胞相關的CD3一、CD144和血管內皮生長因子受體2在SVF中低表達，而且隨著傳代無明顯改變㈣。ADSCs的成脂分化脂肪細胞的分化全進程為：多能干細胞-脂肪母細胞-前脂肪細胞-不成熟脂肪細胞-成熟脂肪細胞。脂肪來源干細胞在分化誘導培育基的作用下可以分化為脂肪細胞，在基礎培育基中，加入0.5mM異丁基甲基黃嘌吟、50^M吲噪美辛、^M地塞米松，培育12?14d后，油紅O染色陽性表示有成熟脂肪細胞形成㈣。新形成的脂肪細胞也能表達脂蛋白酯酶（LPL）、過氧化物酶增殖物活化受體Y（peroxisomeproliferator-activatedreceptor丫,PPARy）、瘦素等，表示該脂肪細胞是由脂肪干細胞誘導分化而來四。結合各類生物支架材料，ADSCs在動物體內也能成功分化形成新的成熟脂肪細胞，而且在一些刺激因子（如胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板源性生長因子等）的作用下，能提高ADSCs的成脂活性四。4臨床應用ADSCs的優勢及應用策略與骨髓間充質干細胞相較，ADSCs有以下長處：①脂肪組織儲量豐碩，來源充沛，取材量大，能反復取材；②組織獲取方式簡單，只需通過吸脂術等簡單的手術方式，不會給患者造成大的痛苦和二次傷害閔；③脂肪組織中干細胞含量豐碩，比骨髓中干細胞高出500倍㈣；④屬于自體移植，無免疫排斥反映；⑤不涉及醫學倫理問題。因此，ADSCs成為組織再生和修復的理想細胞來源。目前，多采用組織工程策略，利用ADSCs來構建脂肪組織。這對于種子細胞和支架材料的選擇，細胞培育的環境和轉移方式都有很高的要求。雖然有很多學者致力于支架材料的研究，將材料進行表面修飾或改形，以提高細胞的黏附增殖能力，但至今仍沒有一種令臨床滿意的支架材料。因此，必需尋求新的途徑和方式。ADSCs的臨床應用現狀目前，脂肪來源干細胞的應用研究多停留在動物實驗階段。日本和歐洲某些國家已開始利用人ADSCs，構建組織工程化脂肪組織，用于修復軟組織缺損。ADSCs臨床應用安全性評價及存在問題據最近的文獻報導，干細胞長期體別傳代，表型將發生改變。培育初期的干細胞維持多向分化的潛能，而培育至晚期的干細胞則表現出一些老化特征，并有細胞癌變的發生。另外，ADSCs的誘導液還常含有與腫瘤發生轉移有關的生長因子，且價錢昂貴。因此，如何高效、廉價、安全地誘導ADSCs分化和應用是目前急需解決的難題?？傊S著分子生物學和細胞生物學的不斷發展，關于ADSCs的研究也會不斷深切。雖然ADSCs應用于脂肪移植臨床實踐的安全性和長期有效性等有待于進一步的評估，其作用機制也有待于進一步的研究，但筆者相信，由于其獨特的優越性，ADSCs必將在整形美容外科領域成為一種理想的軟組織填充物。參考文獻：PatriciaA.Zuk.TheAdipose-derivedStemCell:LookingBackandLookingAhead.MolBiolCell,,1783-1787,June1,2010.GOMILLIONCT,BURGKJ.StemcellsandadiposetissueengineeringJ].Biomaterials,2006,27(36):6052-6063.王潔晴，柏樹令.脂肪來源干細胞研究及臨床應用現狀.中國美容整形外科雜志2009年4月第20卷第4期.楊曉楠，畢會，張蘭成，濮禮臣脂肪干細胞在脂肪組織工程領域的應用.中華醫學美學美容雜志2009年10月第15卷第5期.YoshimuraK,ShigeuraT,MatsumotoD,etal.Characterizationoffreshlyisolatedandculturedcellsderivedfromthefattyandfluidportionsofliposuctionaspirates[J].JCellPhysiol,2006,208⑴：64-76.Prunet-MarcassusB,CousinB,CatonD,etal.Fromheterogeneitytoplasticityinadiposetissues:SitespecificdifferencesJ].ExpCellRes,2006,312:727-736.WickhamMQ,EricsonGR,GimbleJM,etal.MultipotentstromalcellsderivedfromtheinfrapatellarfatpadofthekneeJ].ClinOrthop,2003,412:196-212.vonHeimburqD,ZachariahS,HeschelI,etal.Humanpreadipocytesseededonfreeze-driedcollagenscaffoldsinvestigatedinvitroandinvivoJ].Biomaterials,2001,22(5):429-438.孫曉龍，李青.脂肪干細胞的研究及臨床應用進展.第四軍醫大學學報2009,30(9).MyolotteLA,Duffy,MurphyM,etal.Metabolicflexibilitypermitsmesenchymalstemcellsurvivalinanischemicenvironment[J].StemCells,2008,26(5):1325-1336.SugaH,EtoH,ShigeuraT,etcollection:FGF-2-inducedHGFsecretionbyadipose-derivedstromalcellsinhibitspost-injuryfibrogenesisthroughaJNK-dependentmechanismJ].StemCells,2009,27(1):238-249.UysalAC,MizunoH,TobitaM,etal.TheEffectofAdipose-DerivedStemCellsonIschemia-ReperfusionInjury:ImmunohistochemicalandUltrastructuralEvaluation[J].PlastReconstrSurg,2009,124:804-815.ZhuM,ZhouZY,ChenY,etal.SupplementationofFatGraftsWithAdipose-DerivedRegenerativeCellsImprovesLong-TermGraftRetention[J].AnnPlastSurg,2010,64:222-228.RehmanJ,TraktuevD,LiJ,etal.SecrectionofangiogenicandantiapoptoticfactorsbyhumanadiposestromalcellsJ].Circulation,2004,109(10):1292-1298.ThangarajahH,VialIN,ChangE,etal.IFATScollection:AdiposeStromalcellsadoptaproangiogenicphenotypeundertheinfluenceofhypoxiaJ].StemCells,2009,27(1):266-274.CaoY,SunZ,LiaoLetal.Humanadiposetissue-derivedstemcellsdifferentiateintoendothelialcellsinvitroandimprovepostnatalneovascularizationinvivoJ].BiochemBiophysResCommun,2005,332(2):370-379.TangW,ZeveD,SuhJM,etal.Whitefatprogenitorcellsresideintheadiposevasculature[J].Science,2008,322(5901):583-586.YoshimuraK,SatoK,AoiN,etal.Cell-assistedlipotransfer(CAL)forcosmeticbreastaugmentation:suppor-tiveuseofadipose-derivedstem/stromalcellsJ].AestheticPlastSurg,2008,32(1):48-55.SterodimasA,deFariaJ,NicarettaB,etal.Cell-AssistedLipotransfer[J].AesthetSurgJ,2010,30(1):78-82.YoshimuraK,SugaH,EtoH.Adipose-derivedstem/progenitorcells:rolesinadiposetissueremodelingandpotentialuseforsofttissueaugmentation[J].RegenMed,2009,4(2):265-273.AustL,DevlinB,FosterSJ,etal.Yieldofhumanadipose-derivedadultstemcellsfromliposuctionaspirates[J].Cytotherapy,2004,6(1):7-14.SchipperB,MarraKG,RubinJP.Regionalanatomicandageeffectsoncellsfunctionofhumanadipose-derivedstemcells[J].AnnPlastSurg,2008,60(5):538-544.ZUKPA,ZHUM,MIZUNOH,etal.Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapiesJ].TissueEng,2001,7(2):211-226.KURITAM,MATSUMOTOD,SHIGEURAT,etal.Influencesofcentrifugationoncellsandtissuesinliposuctionaspirates:optimizedcentrifugationforlipotransferandcellisolation[J].PlastR