產前診斷中絨毛、臍血、羊水取樣及標本培養南京大學附屬鼓樓醫院婦產科產前診斷中心李潔副主任醫生2006年11月產前診斷中絨毛、臍血、羊水取樣及標本培養南京大學附屬鼓樓醫院產前診斷指征夫婦任一方有染色體異常；曾生育過染色體病患者；夫婦任一方為單基因病患者；曾生育過單基因病患者；有不明原因的自然流產史、畸胎史、死產或新生兒死亡史；產前診斷指征夫婦任一方有染色體異常；產前診斷指征羊水過多的孕婦；夫婦任一方曾接觸致畸因素；孕婦年齡大于35歲；有遺傳病家族史的近親婚配的夫婦。產前篩查高風險的孕婦超聲胎兒結構篩查胎兒有結構異常的孕婦產前診斷指征羊水過多的孕婦；產前診斷的方法羊膜腔穿刺取樣（amniocentesis）絨毛穿刺取樣（chorionvillussampling,cvs）臍帶血取樣（periumbilicalcordbloodsampling,PUBS）植入前診斷（preimplantatongeneticdiagnosis,PGD）產前診斷的方法羊膜腔穿刺取樣（amniocentesis）產前診斷的方法胎兒組織取樣（皮膚、肝臟）胎兒鏡（fetoscope）胚胎鏡（embryoscope）胎兒超聲波圖象（fetalultrasoundimaging）母體外周血胎兒細胞檢測（cell-storing）產前診斷的方法胎兒組織取樣（皮膚、肝臟）絨毛穿刺取樣—歷史1975年我國鞍山鋼鐵公司鐵東醫院首次問世（經宮頸盲吸法，準確率95%，自然流產率9.3%，出生嬰兒未發現異常）莫斯科產科研究所（超聲引導下經宮頸吸樣）1983您Ward和Brambati分別于英國和意大利發表文章介紹絨毛取樣及核型分析絨毛穿刺取樣—歷史1975年我國鞍山鋼鐵公司鐵東醫院首次問絨毛穿刺取樣—時間妊娠9—11周絨毛穿刺取樣—時間妊娠9—11周絨毛穿刺取樣—抽取量20mg左右（染色體核型分析約需10mg，DNA分析約需5mg，生化測定約需5-10mg）絨毛穿刺取樣—抽取量20mg左右（染色體核型分析約需10m絨毛穿刺取樣—并發癥胎兒丟失胎兒肢體發育缺陷（LRD）絨毛穿刺取樣—并發癥胎兒丟失CVS并發癥—胎兒丟失CVS的流產率不比amniocentesis高經宮頸和經腹取樣安全性相同（Jackson,1992）多胎取樣高于單胎取樣（Pergament,1992）CVS并發癥—胎兒丟失CVS的流產率不比amniocenteCVS并發癥－LRD1999年WHO發布CVS綜合性資料認為CVS與LRD無關（216，381例CVS中115例出現LRD發生率1：1881，總的人群發生率1：1642）世界各地相關資料綜合，9周以下CVS出現LRD的機會高，但原因尚不清楚CVS不應在小于孕10周的條件下進行CVS并發癥－LRD1999年WHO發布CVS綜合性資料認為絨毛穿刺取樣—方法經宮頸（transcervical）經腹（transabdorminal）絨毛穿刺取樣—方法經宮頸（transcervical）CVS方法—經宮頸取樣B超采用高分辨的扇掃式或凸陣式實時超聲診斷儀，經腹探頭頻率3.5MHz,經陰道探頭頻率5-7MHz。采用特制較細的滋養層活檢導管（多聚乙烯導管），其塑料導管外徑1.4–1.6mm,長20cm,帶有導管芯，導管前端稍彎，外形似宮腔探子。導管另一端連接10-20ml含有2-4ml生理鹽水的注射器CVS方法—經宮頸取樣B超采用高分辨的扇掃式或凸陣式實時超聲CVS方法—經腹取樣雙針活檢系統由1根長15cm、外徑1.2mm的18號引導套針，及1根長20cm、外徑0.8mm的22號活檢針組成。在超聲引導下，先將引導套針經腹壁及子宮穿刺入胎盤絨毛邊緣部分，拔出針芯，然后將活檢針經引導套針內送入胎盤絨毛組織,連接含2-4ml生理鹽水的20ml注射器，以5ml的負壓上下移動活檢針吸取絨毛組織CVS方法—經腹取樣雙針活檢系統由1根長15cm、外徑1.2CVS注意事項動作要輕柔穿刺部位在胎盤絨毛葉抽吸次數不宜過多CVS注意事項動作要輕柔羊膜腔穿刺—歷史1956年Fucks進行羊膜腔穿刺行胎兒性別鑒定及胎兒Rh溶血診斷1966年Marksteele和RoyBreg從羊水中分離出羊水細胞培養成功并行胎兒核型分析羊膜腔穿刺—歷史1956年Fucks進行羊膜腔穿刺行胎兒性羊膜腔穿刺—時間16—20周羊膜腔穿刺—時間16—20周羊膜腔穿刺—抽取量20—30ml羊膜腔穿刺—抽取量20—30ml抽取的羊水用途核型分析——診斷染色體病DNA分析——診斷單基因病生化測定——診斷NTD、代謝性疾病抽取的羊水用途核型分析——診斷染色體病羊水穿刺穿刺前孕婦俯臥位搖動腹部超聲波定位引導采用22號或21號帶芯長腰穿刺針頭垂直、快速進針抽取羊水2ml棄置，換空針抽取羊水羊水穿刺羊膜腔穿刺—并發癥胎兒丟失羊膜腔感染羊水滲漏穿刺部位的出血、血腫羊膜腔穿刺—并發癥胎兒丟失羊穿并發癥---胎兒丟失1976年，NihdRegistry報道流產率3.5%1986年，Taboretal報道流產率1.7%1995年，Bombardetal報道流產率1.3%2000年,Antsaklis報道流產率2.1%羊穿并發癥---胎兒丟失1976年，NihdRegistr臍帶血穿刺—歷史1972年，Valenti用兒科膀胱鏡在中期妊娠孕婦行子宮切開術插入羊膜腔，獲取臍血標本。1979年，Rodeck和Campell應用胎兒鏡行臍帶血管穿刺，但由于并發癥高，應用受到限制。1983年，TernandDaffos超聲引導下經皮臍血管穿刺取血（Cordocentesis）臍帶血穿刺—歷史1972年，Valenti用兒科膀胱鏡在中期臍帶血穿刺—時間16周—分娩（最佳24—28周）臍帶血穿刺—時間16周—分娩（最佳24—28周）臍帶血穿刺—取血量3—5ml20周后抽取6—8ml對胎兒循環無不良影響臍帶血穿刺—取血量3—5ml臍帶血穿刺—適應癥胎兒核型分析或基因檢測（胎兒畸形、嚴重的FGR、羊水或絨毛細胞培養失敗、羊水或絨毛培養結果為嵌合體、非免疫性胎兒水腫、脆性X綜合癥等）胎兒血液疾病分析（血型、血小板計數等）胎兒感染（弓形蟲、病毒感染等）胎兒情況評估（酸堿平衡、甲功等）遺傳性疾?。▎位虿?、凝血障礙、血紅蛋白病、代謝性疾病等）胎兒治療（宮內輸血、宮內藥物治療等）臍帶血穿刺—適應癥胎兒核型分析或基因檢測（胎兒畸形、嚴重的F臍帶血穿刺—并發癥穿刺部位的出血臍帶血腫短暫性胎心減慢宮內感染胎兒丟失（流產、早產）大多數并發癥為短暫性和非致命性臍帶血穿刺—并發癥穿刺部位的出血臍帶血穿刺并發癥—胎兒丟失Maxwell1991年報道胎兒超聲結構篩查示正常超聲者臍穿的流產率為1%（1/76）；異常超聲者流產率為7%（5/76）；胎兒結構明顯異常者流產率為25%（9/36）Antsaklis1998年報道胎兒超聲結構篩查示正常超聲者臍穿的流產率1%（2/191）；異常超聲者流產率為13%（11/84）臍帶血穿刺并發癥—胎兒丟失Maxwell1991年報道胎兒臍帶穿刺部位臍帶穿刺部位臍血穿刺—確定胎兒血樣血紅蛋白電泳Kleihauer-Betke試驗：胎兒紅細胞在酸中穩定APT試驗：NaOH中胎兒血為粉紅色有核紅細胞的出現臍血穿刺—確定胎兒血樣血紅蛋白電泳臍血穿刺—排除臍血中母血污染X染色體DMD基因內部5對CA重復序列的連鎖分析臍血穿刺—排除臍血中母血污染X染色體DMD基因內部5對CA重絨毛組織、羊水細胞、臍血細胞培養絨毛組織、羊水細胞、臍血細胞培養絨毛組織的培養直接法培養法（懸浮培養、貼壁培養）絨毛組織的培養直接法絨毛組織的染色體檢查—直接法孕早期Langhan’s細胞有較高的有絲分裂活性，能提供足以分析的良好有絲分裂相，較絨毛培養簡易可靠、操作簡單快速絨毛組織的染色體檢查—直接法孕早期Langhan’s細胞有較絨毛組織的染色體檢查—直接法絨毛組織的分離洗脫加秋水仙素（終濃度2ug/ml，可一次加，也可分次少量加）37OC5%CO2培養箱培養45分鐘低滲（1%枸櫞酸鈉低滲10分鐘或1%枸櫞酸鈉和0.075mol/l1：1低滲40分鐘）預固定（甲醇：冰醋酸3：1）10分鐘固定（甲醇：冰醋酸3：1）10-20分鐘冰醋酸解離絨毛細胞（輕吹打）制片絨毛組織的染色體檢查—直接法絨毛組織的分離洗脫絨毛組織的染色體檢查—懸浮培養法絨毛挑選洗脫絨毛組織剪成小塊入培養瓶（25ml培養瓶每瓶10mg）加特定培養液3ml培養3-6天收獲（加秋素、低滲、固定、制片）絨毛組織的染色體檢查—懸浮培養法絨毛挑選洗脫絨毛組織的染色體檢查—貼壁培養法絨毛組織挑選洗脫絨毛組織剪成小塊加0.25%+0.02%EDTA5ml37OC搖床中20分鐘加培養基終止消化，離心后棄上清加培養基接種培養5-10天收獲絨毛組織的染色體檢查—貼壁培養法絨毛組織挑選洗脫羊水細胞培養—細胞類型成纖維樣細胞（F細胞）上皮樣細胞（密集型上皮樣細胞-E細胞、鐮刀樣上皮細胞、圓形上皮細胞）羊水樣細胞（AF細胞）羊水細胞培養—細胞類型成纖維樣細胞（F細胞）羊水細胞培養—收獲方法原位法消化法刮取法羊水細胞培養—收獲方法原位法羊水細胞培養中存在的問題

——污染細菌真菌支原體病毒其他細胞羊水細胞培養中存在的問題

—羊水細胞培養中存在的問題

——母體細胞污染若胎兒為男性，由于母體細胞污染誤將胎兒診斷為嵌合體母體細胞在培養中占優勢羊水細胞培養中存在的問題

—羊水細胞培養中存在的問題

——母體細胞污染的預防羊水穿刺時，把最先抽得的1-2ml羊水棄掉染色體多態現象的測試羊水細胞、母體細胞的HLA組織定型鑒別羊水細胞培養中存在的問題

—羊水細胞培養中存在的問題

——細胞不生長、不貼壁最常見的原因是支原體污染培養基PH不適當，偏酸（＜6.4或偏堿＞7.4均不利最合適的穿刺時間16-20周羊水細胞培養中存在的問題

—羊水細胞培養中存在的問題

——細胞及染色體收獲少每天觀察細胞生長（梭形細胞背景上有透明透亮的圓形細胞）滾圓的細胞與有絲分裂的圓形細胞鑒別操作應輕柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消化的時間羊水中胎脂多時3-5天可輕輕動一動，減少胎脂貼壁占據空間低滲時間短于外周血（一般3-5分鐘）羊水細胞培養中存在的問題

—臍帶血細胞培養量少于外周血（一般5ml注射器小于14滴）其他同外周血臍帶血細胞培養量少于外周血（一般5ml注射器小于14滴）Thanks!Thanks!產前診斷中絨毛、臍血、羊水取樣及標本培養南京大學附屬鼓樓醫院婦產科產前診斷中心李潔副主任醫生2006年11月產前診斷中絨毛、臍血、羊水取樣及標本培養南京大學附屬鼓樓醫院產前診斷指征夫婦任一方有染色體異常；曾生育過染色體病患者；夫婦任一方為單基因病患者；曾生育過單基因病患者；有不明原因的自然流產史、畸胎史、死產或新生兒死亡史；產前診斷指征夫婦任一方有染色體異常；產前診斷指征羊水過多的孕婦；夫婦任一方曾接觸致畸因素；孕婦年齡大于35歲；有遺傳病家族史的近親婚配的夫婦。產前篩查高風險的孕婦超聲胎兒結構篩查胎兒有結構異常的孕婦產前診斷指征羊水過多的孕婦；產前診斷的方法羊膜腔穿刺取樣（amniocentesis）絨毛穿刺取樣（chorionvillussampling,cvs）臍帶血取樣（periumbilicalcordbloodsampling,PUBS）植入前診斷（preimplantatongeneticdiagnosis,PGD）產前診斷的方法羊膜腔穿刺取樣（amniocentesis）產前診斷的方法胎兒組織取樣（皮膚、肝臟）胎兒鏡（fetoscope）胚胎鏡（embryoscope）胎兒超聲波圖象（fetalultrasoundimaging）母體外周血胎兒細胞檢測（cell-storing）產前診斷的方法胎兒組織取樣（皮膚、肝臟）絨毛穿刺取樣—歷史1975年我國鞍山鋼鐵公司鐵東醫院首次問世（經宮頸盲吸法，準確率95%，自然流產率9.3%，出生嬰兒未發現異常）莫斯科產科研究所（超聲引導下經宮頸吸樣）1983您Ward和Brambati分別于英國和意大利發表文章介紹絨毛取樣及核型分析絨毛穿刺取樣—歷史1975年我國鞍山鋼鐵公司鐵東醫院首次問絨毛穿刺取樣—時間妊娠9—11周絨毛穿刺取樣—時間妊娠9—11周絨毛穿刺取樣—抽取量20mg左右（染色體核型分析約需10mg，DNA分析約需5mg，生化測定約需5-10mg）絨毛穿刺取樣—抽取量20mg左右（染色體核型分析約需10m絨毛穿刺取樣—并發癥胎兒丟失胎兒肢體發育缺陷（LRD）絨毛穿刺取樣—并發癥胎兒丟失CVS并發癥—胎兒丟失CVS的流產率不比amniocentesis高經宮頸和經腹取樣安全性相同（Jackson,1992）多胎取樣高于單胎取樣（Pergament,1992）CVS并發癥—胎兒丟失CVS的流產率不比amniocenteCVS并發癥－LRD1999年WHO發布CVS綜合性資料認為CVS與LRD無關（216，381例CVS中115例出現LRD發生率1：1881，總的人群發生率1：1642）世界各地相關資料綜合，9周以下CVS出現LRD的機會高，但原因尚不清楚CVS不應在小于孕10周的條件下進行CVS并發癥－LRD1999年WHO發布CVS綜合性資料認為絨毛穿刺取樣—方法經宮頸（transcervical）經腹（transabdorminal）絨毛穿刺取樣—方法經宮頸（transcervical）CVS方法—經宮頸取樣B超采用高分辨的扇掃式或凸陣式實時超聲診斷儀，經腹探頭頻率3.5MHz,經陰道探頭頻率5-7MHz。采用特制較細的滋養層活檢導管（多聚乙烯導管），其塑料導管外徑1.4–1.6mm,長20cm,帶有導管芯，導管前端稍彎，外形似宮腔探子。導管另一端連接10-20ml含有2-4ml生理鹽水的注射器CVS方法—經宮頸取樣B超采用高分辨的扇掃式或凸陣式實時超聲CVS方法—經腹取樣雙針活檢系統由1根長15cm、外徑1.2mm的18號引導套針，及1根長20cm、外徑0.8mm的22號活檢針組成。在超聲引導下，先將引導套針經腹壁及子宮穿刺入胎盤絨毛邊緣部分，拔出針芯，然后將活檢針經引導套針內送入胎盤絨毛組織,連接含2-4ml生理鹽水的20ml注射器，以5ml的負壓上下移動活檢針吸取絨毛組織CVS方法—經腹取樣雙針活檢系統由1根長15cm、外徑1.2CVS注意事項動作要輕柔穿刺部位在胎盤絨毛葉抽吸次數不宜過多CVS注意事項動作要輕柔羊膜腔穿刺—歷史1956年Fucks進行羊膜腔穿刺行胎兒性別鑒定及胎兒Rh溶血診斷1966年Marksteele和RoyBreg從羊水中分離出羊水細胞培養成功并行胎兒核型分析羊膜腔穿刺—歷史1956年Fucks進行羊膜腔穿刺行胎兒性羊膜腔穿刺—時間16—20周羊膜腔穿刺—時間16—20周羊膜腔穿刺—抽取量20—30ml羊膜腔穿刺—抽取量20—30ml抽取的羊水用途核型分析——診斷染色體病DNA分析——診斷單基因病生化測定——診斷NTD、代謝性疾病抽取的羊水用途核型分析——診斷染色體病羊水穿刺穿刺前孕婦俯臥位搖動腹部超聲波定位引導采用22號或21號帶芯長腰穿刺針頭垂直、快速進針抽取羊水2ml棄置，換空針抽取羊水羊水穿刺羊膜腔穿刺—并發癥胎兒丟失羊膜腔感染羊水滲漏穿刺部位的出血、血腫羊膜腔穿刺—并發癥胎兒丟失羊穿并發癥---胎兒丟失1976年，NihdRegistry報道流產率3.5%1986年，Taboretal報道流產率1.7%1995年，Bombardetal報道流產率1.3%2000年,Antsaklis報道流產率2.1%羊穿并發癥---胎兒丟失1976年，NihdRegistr臍帶血穿刺—歷史1972年，Valenti用兒科膀胱鏡在中期妊娠孕婦行子宮切開術插入羊膜腔，獲取臍血標本。1979年，Rodeck和Campell應用胎兒鏡行臍帶血管穿刺，但由于并發癥高，應用受到限制。1983年，TernandDaffos超聲引導下經皮臍血管穿刺取血（Cordocentesis）臍帶血穿刺—歷史1972年，Valenti用兒科膀胱鏡在中期臍帶血穿刺—時間16周—分娩（最佳24—28周）臍帶血穿刺—時間16周—分娩（最佳24—28周）臍帶血穿刺—取血量3—5ml20周后抽取6—8ml對胎兒循環無不良影響臍帶血穿刺—取血量3—5ml臍帶血穿刺—適應癥胎兒核型分析或基因檢測（胎兒畸形、嚴重的FGR、羊水或絨毛細胞培養失敗、羊水或絨毛培養結果為嵌合體、非免疫性胎兒水腫、脆性X綜合癥等）胎兒血液疾病分析（血型、血小板計數等）胎兒感染（弓形蟲、病毒感染等）胎兒情況評估（酸堿平衡、甲功等）遺傳性疾?。▎位虿?、凝血障礙、血紅蛋白病、代謝性疾病等）胎兒治療（宮內輸血、宮內藥物治療等）臍帶血穿刺—適應癥胎兒核型分析或基因檢測（胎兒畸形、嚴重的F臍帶血穿刺—并發癥穿刺部位的出血臍帶血腫短暫性胎心減慢宮內感染胎兒丟失（流產、早產）大多數并發癥為短暫性和非致命性臍帶血穿刺—并發癥穿刺部位的出血臍帶血穿刺并發癥—胎兒丟失Maxwell1991年報道胎兒超聲結構篩查示正常超聲者臍穿的流產率為1%（1/76）；異常超聲者流產率為7%（5/76）；胎兒結構明顯異常者流產率為25%（9/36）Antsaklis1998年報道胎兒超聲結構篩查示正常超聲者臍穿的流產率1%（2/191）；異常超聲者流產率為13%（11/84）臍帶血穿刺并發癥—胎兒丟失Maxwell1991年報道胎兒臍帶穿刺部位臍帶穿刺部位臍血穿刺—確定胎兒血樣血紅蛋白電泳Kleihauer-Betke試驗：胎兒紅細胞在酸中穩定APT試驗：NaOH中胎兒血為粉紅色有核紅細胞的出現臍血穿刺—確定胎兒血樣血紅蛋白電泳臍血穿刺—排除臍血中母血污染X染色體DMD基因內部5對CA重復序列的連鎖分析臍血穿刺—排除臍血中母血污染X染色體DMD基因內部5對CA重絨毛組織、羊水細胞、臍血細胞培養絨毛組織、羊水細胞、臍血細胞培養絨毛組織的培養直接法培養法（懸浮培養、貼壁培養）絨毛組織的培養直接法絨毛組織的染色體檢查—直接法孕早期Langhan’s細胞有較高的有絲分裂活性，能提供足以分析的良好有絲分裂相，較絨毛培養簡易可靠、操作簡單快速絨毛組織的染色體檢查—直接法孕早期Langhan’s細胞有較絨毛組織的染色體檢查—直接法絨毛組織的分離洗脫加秋水仙素（終濃度2ug/ml，可一次加，也可分次少量加）37OC5%CO2培養箱培養45分鐘低滲（1%枸櫞酸鈉低滲10分鐘或1%枸櫞酸鈉和0.075mol/l1：1低滲40分鐘）預固定（甲醇：冰醋酸3：1）10分鐘固定（甲醇：冰醋酸3：1）10-20分鐘冰醋酸解離絨毛細胞（輕吹打）制片絨毛組織的染色體檢查—直接法絨毛組織的分離洗脫絨毛組織的染色體檢查—懸浮培養法絨毛挑選洗脫絨毛組織剪成小塊入培養瓶（25ml培養瓶每瓶10mg）加特定培養液3ml培養3-6天收獲（加秋素、低滲、固定、制片）絨毛組織的染色體檢查—懸浮培養法絨毛挑選洗脫