ISO15189認可對分子診斷設備

的要求及應用中的問題沈佐君shenzuojun@163.comISO15189認可對分子診斷設備

的要求及應用中的問題沈佐1主要內容一、開展分子診斷檢測的國家及行業相關規定二、開展分子診斷檢測涉及的主要設備三、ISO15189在分子診斷領域的應用說明簡介四、ISO15189對分子診斷設備的性能要求五、ISO15189對分子診斷檢測的系統完整性要求六、分子診斷設備制造商在幫組用戶通過ISO15189認可過程中應注意的問題主要內容一、開展分子診斷檢測的國家及行業相關規定2第一部分開展分子診斷檢測的國家及行業相關規定第一部分3分子診斷的基本概念基因體外擴增檢驗，通常稱為PCR檢驗2002-2009年:該檢驗項目是目前我國臨床檢驗項目中唯一一項需要通過衛生部或省級臨床檢驗中心現場技術驗收合格方可開展臨床檢驗的技術準入項目。2009年5月1日后：衛生部關于印發《醫療技術臨床應用管理辦法》的通知（衛醫政發〔2009〕18號）和《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號）。分子診斷的基本概念4醫療技術分為三類：第一類：醫療技術是指安全性、有效性確切，醫療機構通過常規管理在臨床應用中能確保其安全性、有效性的技術。第二類：醫療技術是指安全性、有效性確切，涉及一定倫理問題或者風險較高，衛生行政部門應當加以控制管理的醫療技術。（如PCR）第三類：醫療技術是指具有下列情形之一，需要衛生行政部門加以嚴格控制管理的醫療技術：（1）涉及重大倫理問題；（2）高風險；（3）安全性、有效性尚需經規范的臨床試驗研究進一步驗證；（4）需要使用稀缺資源；（5）衛生部規定的其他需要特殊管理的醫療技術。（共19項，第8項基因芯片診斷技術，現劃為第二類）醫療技術分為三類：5衛生部負責第三類醫療技術的臨床應用管理工作。第三類醫療技術目錄由衛生部制定公布，并根據臨床應用實際情況，予以調整。省級衛生行政部門負責第二類醫療技術臨床應用管理工作。第二類醫療技術目錄由省級衛生行政部門根據本轄區情況制定并公布，報衛生部備案。衛生部負責第三類醫療技術的臨床應用管理工作。6醫療技術臨床應用

能力審核屬于第三類的醫療技術首次應用于臨床前，必須經過衛生部組織的安全性、有效性臨床試驗研究、論證及倫理審查。

第二類醫療技術和第三類醫療技術臨床應用前實行第三方技術審核制度。

對醫務人員開展第一類醫療技術臨床應用的能力技術審核，由醫療機構自行組織實施，也可以由省級衛生行政部門規定。

衛生部指定或者組建的機構、組織（以下簡稱技術審核機構）負責第三類醫療技術臨床應用能力技術審核工作（1.中國醫學科學院、2.中華醫學會、3.中國醫院協會、4.中華醫師協會、5.中華口腔醫學會）。

省級衛生行政部門指定或者組建的技術審核機構負責第二類醫療技術臨床應用能力技術審核工作。

衛生部可以委托省級衛生行政部門組織對指定的第三類醫療技術進行臨床應用能力技術審核工作。醫療技術臨床應用能力審核7對開展分子診斷檢測實驗室的要求：實驗室流程布局人員上崗證書實驗室的管理（參照ISO17025，10章38款）規范的應該是：實驗室驗收合格證書（技術審核報告）+衛生行政部門的登記（診療科目）對開展分子診斷檢測實驗室的要求：8第二部分開展分子診斷檢測涉及的主要設備第二部分9主要設備（5.5檢驗過程）1、核酸提取儀2、PCR

（1）普通PCR儀（2）實時熒光PCR儀

（3）液體芯片3、雜交儀4、基因芯片5、一體化/工作站6、測序儀主要設備（5.5檢驗過程）10輔助設備（5.2設施和環境條件）1、加樣器2、金屬浴3、離心機4、冰箱5、生物安全柜6、UPS7、純水器（能除RNA酶）輔助設備（5.2設施和環境條件）11第三部分ISO15189在分子診斷領域的應用說明簡介：5.2、5.3、5.5及附錄第三部分12醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明

CNAS-CL36

2014年4月21日第一次修訂，2014年11月1日實施醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明

CNA131范圍本文件規定了CNAS對分子診斷領域的認可要求，包括：病原體核酸和人體基因等領域涉及的核酸擴增試驗、雜交試驗（包括解剖病理中的原位雜交試驗）、核酸電泳分析等。

注：“分子診斷”包括檢驗醫學領域的“分子檢驗”以及病理學檢查領域的“分子病理”。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改單）適用于本文件。GB/T20468-2006臨床實驗室定量測定室內質量控制指南CNAS-RL02能力驗證規則CNSA-CL31內部校準要求臨床技術操作規范·病理學分冊醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則病理科建設與管理指南（試行），衛辦醫政發〔2009〕31號3術語和定義1范圍14標本接收與處理：流程和標本是否合格的要點試劑耗材質檢：為何要質檢、如何做核酸提取：原理和操作技術要領防污染：措施和意識質量控制：程序和實際運行情況、失控的分析處理結果分析與判斷：結果審核、報告發放評審中考核的主要內容標本接收與處理：流程和標本是否合格的要點評審中考核的主要內容155.2設施和環境條件

5.2.1

應實施安全風險評估，如果設置了不同的控制區域，應制定針對性的防護措施及合適的警告。5.2.2涉及基因擴增檢驗的實驗室原則上分四個獨立的工作區域：試劑貯存和準備區；樣品制備區；擴增區；擴增產物分析區。如使用自動分析儀（擴增產物閉管檢測），擴增區和擴增產物分析區可合并。具體實驗室分區應依據其所使用的技術平臺及檢驗項目和工作量而定。

上述每個區域應有充足空間以保證：樣品處置符合分析前、后樣品分區放置；儀器放置符合維修和操作要求；樣品制備區放置生物安全柜、離心機和冰箱等儀器設備；打印檢驗報告時交叉污染的控制。5.2設施和環境條件5.2.1應實施165.2設施和環境條件工作區域應符合如下要求：c）實驗室各分區應配置固定和移動紫外線燈，波長為254nm，照射時離實驗臺的高度一般為60～90cm；e）樣品制備區應配置二級生物安全柜和洗眼器，實驗室附近應有噴淋裝置。所有分子病理實驗室均應設置獨立的標本前處理區，包括切片區和脫蠟區，用于組織切片、脫蠟、水化、染色等。脫蠟、水化及染色應在通風設施中進行。5.2設施和環境條件工作區域應符合如下要求：175.2設施和環境條件5.2.3用以保存臨床樣品和試劑的設施應設置目標溫度和允許范圍，并記錄。實驗室應有溫度失控時的處理措施并記錄。5.2.6不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。工作結束后應立即對工作區進行清潔，必要時進行消毒及去污染。

應依據所用分析設備和實驗過程的要求，制定環境溫濕度控制要求并記錄。應有溫濕度失控時的處理措施并記錄。

擴增儀應配備不間斷電源（UPS）；

應依據用途（如：RNA檢測用水），制定適宜的水質標準（如：應除RNase），并定期檢測。

分子檢驗各工作區域應有明確的標記。進入基因擴增實驗室各工作區應按照單一方向進行，即試劑貯存和準備區→樣品制備區→擴增區→擴增產物分析區。不同的工作區域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區域時，不應將工作服帶出。5.2設施和環境條件5.2.3用以保存臨床樣品和試劑的設施185.3實驗室設備、試劑和耗材

如從事RNA檢測，宜配備－70℃的冷凍設備。需要時，配備高速冷凍離心機。標本制備區使用的一次性加樣器吸頭應帶有濾芯。PCR試驗用容器應可密閉，不同工作區域內的設備、物品不能混用。組織標本前處理區的設備通常應包括切片機、裱片機、切片刀、電熱恒溫箱、脫蠟缸、水化缸及HE染色缸等。5.3實驗室設備、試劑和耗材如從事RNA檢測195.3實驗室設備

應按國家法規要求對強檢設備進行檢定。應進行外部校準的設備，如果符合檢測目的和要求，可按制造商校準程序進行。應至少對分析設備的加樣系統、檢測系統和溫控系統進行校準（適用時）。分析設備和輔助設備的內部校準應符合CNAS-CL31《內部校準要求》。ABI5700FAM?/SYBR?GreenI，VIC?/JOE?，NED?/TAMRA?/Cy3?，ROX?/Texas-Red?和Cy5?應定期對基因擴增儀、加樣器、溫度計、恒溫設備、離心機和生物安全柜等進行校準。5.3實驗室設備應按國家法規要求對強檢設備20樣本升降溫速率：快速模式：－1.6-＋0.8℃/秒

標準模式：±1.6℃/秒加熱塊最高升降溫速率：2.5℃/秒溫度范圍：4℃-100℃溫度精度：設置值/顯示溫度的±0.25℃(35℃至95℃)(時鐘啟動后3分鐘開始測量)溫度均一性：±0.5℃(35℃至95℃)(時鐘啟動后30秒開始測量)光學系統：五色激發光濾光片，五色發射光濾光片和CCD成像系統安裝時已校準染料：SYBR?GreenI，FAM?，VIC?，JOE?，NED?，TAMRA?，ROX?，Texas

Red?，Cy3?，Cy5?。被動參照染料：ROX?樣本升降溫速率：快速模式：－1.6-＋0.8℃/秒215.3實驗室設備

設備故障后，應首先分析故障原因，如果設備故障可能影響了方法學性能，故障修復后，可通過以下合適的方式進行相關的檢測、驗證：(a)可校準的項目實施校準驗證，必要時，實施校準；(b)質控物檢驗；(c)與其他儀器或方法比對，偏差符合附錄A.3的要求；(d)以前檢驗過的樣品再檢驗，偏差符合附錄A.5的要求。5.3實驗室設備設備故障后，應首先分析225.3實驗室設備

實驗室應建立試劑和關鍵耗材（如離心管、帶濾芯的吸頭）的驗收程序，相應程序中應有明確的判斷符合性的方法和質量標準（宜參考附錄A）。

實驗室應對新批號或同一批號不同貨運號的試劑和關鍵耗材進行驗收，驗收試驗至少應包括：外觀檢查：肉眼可看出的，如包裝完整性、有效期等；性能驗證：通過實驗才能判斷的，如試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率、試劑的批間差異、關鍵耗材的抑制物等。5.3實驗室設備實驗室應建立試劑和關鍵耗材235.3實驗室設備

試劑性能驗證記錄應能反映該批試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率。一般情況下，臨床實驗室在新批號試劑或關鍵耗材使用前，應驗證試劑批間差異和耗材的抑制物，符合附錄A.6要求即可視為滿足要求。特殊情況下，如實驗室懷疑提取試劑有質量問題，可采用凝膠電泳試驗比較核酸提取物與核酸標準物確認核酸片段提取的完整性、260nm紫外波長測定確認核酸提取的產率、260nm/280nm比值確認核酸提取的純度。5.3實驗室設備試劑性能驗證記錄應能反24靶核酸提取的質量純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標準比較測定。核酸提取的產率：可在A260讀數測定。核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用已知病原體含量的溶血和/或脂血標本用待評價試劑提取，然后進行擴增檢測，比較所得到的結果。靶核酸提取的質量純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的25用于定性檢驗的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進行試劑批號驗證。用于定量檢驗的試劑，應進行新舊試劑批間的差異驗證，方法和要求參照附錄A.6要求。耗材的抑制物驗收：對關鍵耗材應檢測是否存在核酸擴增的抑制物，方法和要求參照附錄A.6要求。5.3實驗室設備用于定性檢驗的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進行試劑批號驗證。26試劑質檢

強調采用患者標本進行試劑質檢的意義：PCR實驗時兩個關鍵步驟：（1）從標本中提取核酸；（2）提取核酸的擴增。商品化的質控品和標準曲線的結果良好，并非能反映提取試劑的質量。試劑質檢強調采用患者標本進行試劑質檢的意義：27推薦的試劑質檢方案標本選擇：一般選擇已用老試劑測定過的患者標本5份，其中一份陰性，其余4份一般要盡可能涵蓋高、中、低、臨界等濃度差。結果判斷：用新試劑重復測定上述5份標本，計算偏差(%)；判斷標準(根據實驗室室內質控RCV和能力驗證允許總誤差TEa)；關注臨界值和高值！推薦的試劑質檢方案標本選擇：一般選擇已用老試劑測定過的患者標285.5檢驗過程

定量檢測方法和程序的分析性能驗證內容至少應包括精密度、正確度、線性、測量和/或可報告范圍、抗干擾能力等。定性檢測項目驗證內容至少應包括測定下限、特異性、準確度（方法學比較或與金標準比較）、抗干擾能力等。驗證結果應經過授權人審核。應使用驗證過的核酸抽提和純化方法，必要時進行核酸定量。5.5檢驗過程定量檢測方法和程序的分析29

對產前檢驗，在完成分子診斷前應保留備份培養物并跟蹤監測實驗的準確性；在檢驗胎兒標本前，應檢驗父母一方或雙方的突變狀態，宜由同一實驗室檢驗；如有足夠的標本，應從兩份不同標本中提取DNA進行雙份檢驗。實驗室應了解檢驗方法受母體細胞污染的影響，應有程序評估并減少這種影響。

應有明確和統一的原位雜交（ISH）陽性信號的標準，并建立本實驗室的陽性閾值。組織病理ISH，應結合組織形態進行結果判讀，并采用國際通用的評分標準。5.5檢驗過程對產前檢驗，在完成分子診斷前應保留備份培養305.6檢驗結果質量的保證

總則應制定室內質量控制程序，定量測定可參照GB/T20468-2006《臨床實驗室定量測定室內質量控制指南》。質量控制程序中應有針對核酸檢測防污染的具體措施。應保留DNA質量評價記錄。需要時，應對RNA的質量進行評價，并選擇合適的“管家”mRNA作為內對照以評價所提取RNA的完整性，并保留RNA質量評價記錄及假陰性率監測記錄。對用于基因突變檢測的石蠟包埋樣品，應有病理醫師從組織形態學對腫瘤細胞的存在與否及其數量進行評價，并決定是否需要對腫瘤細胞進行富集。當分子診斷結果與臨床和其他實驗結果不符時，應記錄并分析原因，適當時采取糾正措施。5.6檢驗結果質量的保證總則315.6檢驗結果質量的保證

質控物定性檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和/或陽性質控物。如為基因突變、基因多態性或基因型檢測，則應包括最能反映檢測情況的突變或基因型樣品，每批檢測的質控至少應有一種基因突變或基因型。定量檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和陽性質控物。5.6檢驗結果質量的保證質控物325.6檢驗結果質量的保證

質控數據質控規則應確保試驗的穩定性和檢驗結果的可靠性。定量檢測項目：控圖應包括質控結果、質控物名稱、濃度、批號和有效期、質控圖的中心線和控制界線、分析儀器名稱和唯一標識、方法學名稱、檢驗項目名稱、試劑和校準物批號、每個數據點的日期和時間、干擾行為的記錄、質控人員及審核人員的簽字、失控時的分析處理程序和糾正措施等。定性檢測項目：陰陽性符合預期。5.6檢驗結果質量的保證質控數據335.6檢驗結果質量的保證

通過與其他實驗室（如已獲認可的實驗室、使用相同檢測方法的實驗室、使用配套系統的實驗室）比對的方式確定檢驗結果的可接受性時，應滿足如下要求：（a）規定比對實驗室的選擇原則；（b）樣品數量：至少5份，包括正常和異常水平或不同常見基因突變或基因型；（c）頻率：至少每年2次；（d）判定標準：應有≥80%的結果符合要求。5.6檢驗結果質量的保證通過與其他實驗室（345.6檢驗結果質量的保證5.6.4實驗室使用兩套及以上檢測系統檢測同一項目時，應有比對數據表明其檢測結果的一致性，比對頻次每年至少1次，樣品數量不少于20，濃度水平應覆蓋測量區間；應定期（至少每年1次，每次至少5份臨床樣品）進行檢驗人員的結果比對、考核并記錄。比對結果應符合附錄A的要求。使用不同生物參考區間的檢測系統間不宜進行比對。比對記錄應由實驗室負責人審核并簽字，并應保留至少2年。5.6檢驗結果質量的保證5.6.4實驗室使用兩套及以上35一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理核酸的分離純化靶核酸提取的質量臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質核酸樣本制備及擴增檢測的質控產物檢測的質控核酸樣本的制備、擴增檢測及其質量控制一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理核酸樣本的制備、36一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理靶核酸可以與宿主細胞整合，核內游離及胞漿內各種構形存在于細胞內，如測定的是病原微生物,則靶核酸存在于細菌、病毒、原蟲或真菌細胞內，如果上述細胞破裂,則靶核酸亦可存在于細胞外。一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結合于核酸的蛋白質，從而將靶核酸從細胞內釋放出來。一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理靶核酸可以與宿主37核酸的分離純化核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增的物質去除。經典方法硅吸附法磁珠吸附法對于商品核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。核酸的分離純化核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增38臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質臨床標本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機溶劑。臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質臨床標本中：血清39實驗室質量控制方案實驗室應有室內質控方案和室間質評計劃1.室內質量控制標準操作程序；

陽性對照、陰性對照、試劑空白對照、

陽性（臨界值）對照

2.實驗室應參加EQA。失控結果的分析，糾正措施及其效果評價等。實驗室質量控制方案實驗室應有室內質控方案和室間質評計劃40質控物的質量保證無商品化質控物時，可采用自制的質控物。質控物的評價：均一性、瓶間差、穩定性等。理想質控物：基質與待測樣本一致；所含待測物濃度接近試驗的決定性水平；穩定；靶值或預期結果已定；無已知的生物傳染危險性；單批可大量獲得；價廉。質控物的質量保證無商品化質控物時，可采用自制的質控物。41定量PCR試驗HCV-RNA使用GBW09151標準物質驗證準確性，定值1.09±0.27×105IU/ml，實測0.79×105IU/ml，偏差27.5%，超出定值范圍，未進行處理（5.6.3）。不符合項案例定量PCR試驗HCV-RNA使用GBW09151標準物質驗證直接計算：偏差=[（1.09-0.79）105/1.09×105]×100%=27.5%（同不符合項）；但是，取對數計算：log1.09×105=5.0374；log0.79×105=4.8976；偏差=[（5.0374-4.8976）/5.0374]×100%=2.78%。即：直接用IU/ml計算為27.5%（數值較大），取對數后為2.78%（數值較小）。假定一個樣品靶值為1×104，如果檢測結果為1×103，則（1×103-1×104）/1×104=0.9=90%;如果檢測結果為1×105，則（1×105-1×104）/1×104=9=900%。取對數計算：log1×103=3，og1×104=4，log1×105=5，則（4-3）/4=0.25=25%（非90%）,（4-5）/4=-0.25=-25%（非900%）。以上數據說明，如果直接按IU/ml或copies/ml繪制質控圖或計算CV%會導致失真，原因是我們通過體外擴增來推算樣本中核酸的模板量，但擴增的產物是2的N次方，放大了。這是強調為什么要取對數計算的原因。直接計算：偏差=[（1.09-0.79）105/1.09×43附錄A（規范性附錄）分子診斷項目分析性能標準A.1應不低于國家標準、行業標準、地方法規要求。A.2自建檢測系統不精密度要求：以能力驗證/室間質評評價界限（靶值0.4對數值）作為允許總誤差（TEa），重復性精密度<3/5TEa；中間精密度<4/5TEa。A.3設備故障修復后，分析系統比對：5份樣品，覆蓋測量區間，至少4份樣品測量結果偏倚<7.5%。A.4實驗室內分析系統定期比對：樣品數n≥20，濃度應覆蓋測量區間，計算回歸方程，系統誤差應<7.5%。A.5留樣再測判斷標準：按照項目穩定性要求選取最長期限樣品，5個樣品，覆蓋測量區間，至少4個樣品測量結果偏倚<7.5%。A.6試劑批間差異、耗材的抑制物的驗收判斷標準：選取5個舊批號檢測過的樣品，覆蓋測量區間（包括陰性、臨界值、低值、中值和高值），至少4個樣品測量結果偏倚<7.5%，其中陰性和臨界值樣品必須符合預期。A.7沒有標準和室間質評要求時，實驗室間結果比對合格標準可依據制造商聲明的性能標準而制定。附錄A（規范性附錄）A.1應不低于國家標準、行業標準、地方44附錄B（規范性附錄）分子診斷領域申請認可項目要求B.1以下分子檢驗項目，每一組項目為完整能力項目，如果實驗室開展以下項目組合，則申請該組中任一項目時，應同時申請其它項目（第3系列除外，但須至少申請其中的3項）。同一項目使用不同儀器

/方法報告結果時，全部儀器

/方法均應申請認可。1.肝炎系列：HBV、HCV（實驗室僅開展1項者除外）；2.優生優育（TORCH）系列：TXO、RV、CMV、HSV；3.泌尿生殖道性傳播疾病病原體系列：CT、NG、UU、HPV、HSV、TP。B.2分子病理檢測項目，至少應申請以下任意兩個系列，每個系列至少申請一項。同一項目使用不同儀器

/方法報告結果時，全部儀器

/方法均應申請認可。1.突變檢測：EGFR、KRAS、BRAF、C-KIT、PDGFRA等；2.擴增系列：Her-2等；3.易位：EWS、Bcl-2、C-MYC、Bcl-6、ALK等；4.基因重排：IGH、IGK、IGL、TCR等。附錄B（規范性附錄）B.1以下分子檢驗項目，每一組項目為完45第四部分ISO15189對分子診斷設備的性能要求第四部分46檢驗過程檢驗程序的選擇、驗證和確認

總則實驗室應選擇預期用途經過確認的檢驗程序。每一檢驗程序的規定要求（性能特征）應與該檢驗的預期用途相關。首選程序可以是體外診斷醫療器械使用說明中規定的程序，或公認的/權威的教科書、經同行審議過的文章或雜志發表的，或國際公認標準或指南中的，或國家、地區法規中的程序。1.篩查：靈敏度2.確認：特異性3.治療：定量檢驗過程檢驗程序的選擇、驗證和確認47預期用途：

篩查、確認、定性、定量、診斷和治療1.篩查：靈敏度高、快速和方便（如POCT）。確認：特異性好。診斷和治療：定量準確、測量區間寬、檢測限（如超敏方法，要關注最低檢出限、線性、測量區間等性能參數）。實驗室應有項目性能特征的清單！預期用途：

篩查、確認、定性、定量、診斷和治療1.篩查：48預期用途預期用途49預期用途ProcleixUltrioAssay*是一種體外核酸定性檢測系統，用于篩查來自人類血漿樣本中的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）RNA、丙型肝炎病毒（HCV）RNA和乙型肝炎病毒（HBV）DNA。本試劑盒可用于檢測單份的血漿樣本，也可用于檢測由不超過16個單份的血漿樣本等量混合后的人血漿混合物。此檢測不能用于協助診斷HIV-1、HCV或HBV感染。預期用途ProcleixUltrioAssay*是一種50預期用途預期用途51INTENDEDUSETheARCHITECTHBsAgassayisachemiluminescentmicroparticleimmunoassay(CMIA)forthequantitative

（定量）determinationofhepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)inhumanserumandplasma.

HBsAgassaysareroutinelyusedtoaidinthediagnosis（輔助診斷）

ofsuspectedhepatitisBviral(HBV)infectionandtomonitorthestatusofinfectedindividuals,i.e.,whetherthepatient’sinfectionhasresolvedorthepatienthasbecomeachroniccarrierofthevirus.預期用途INTENDEDUSE預期用途52預期用途預期用途53INTENDEDUSETheARCHITECTHBsAgQualitativeIIassayisachemiluminescentmicroparticleimmunoassay(CMIA)forthequalitativedetection

ofhepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)inhumanserumandplasma.TheARCHITECTHBsAgQualitativeIIassayisintendedtobeusedasanaidinthediagnosisofHBVinfectionandasascreeningtestfordonatedbloodandplasma.HBsAgassaysareusedtoidentifypersonsinfectedwithHBVandtopreventtransmissionofthevirusbybloodandbloodproductsaswellastomonitorthestatusofinfectedindividualsincombinationwithotherhepatitisBserologicalmarkers.Inmostcountries,testingforHBsAgispartoftheantenatalscreeningprogramtoidentifyHBVinfectedmothersandtopreventperinatalHBVinfectionbysubsequentimmunization.預期用途INTENDEDUSE預期用途54預期用途預期用途55預期用途INTENDEDUSEAxSYMAnti-HCV(hepatitisCvirus)isaMicroparticleEnzymeImmunoassay(MEIA)forthequalitativedetectionofanti-HCVIgGtoHCVrecombinantproteinsinhumanserumorplasma(potassiumEDTA,sodiumEDTA,sodiumheparin,lithiumheparin,sodiumcitrateandpotassiumoxalate).Assayresults,inconjunctionwithotherlaboratoryresultsandclinicalinformation,maybeusedtoprovidepresumptiveevidenceofinfectionwithHCVvirus(stateofinfectionorassociateddiseasenotdetermined)inpersonswithsignsorsymptomsofhepatitisandinpersonsatriskforhepatitisCinfection.WARNING:Notintendedforuseinscreening?blood,plasma,ortissuedonors.TheeffectivenessofAxSYMAnti-HCVforuseinscreeningblood,plasma,ortissuedonorshasnotbeenestablished.?Assayperformancecharacteristicshavenotbeenestablishedforprenatalscreeningortestingapediatricpopulationlessthan10yearsofage.預期用途INTENDEDUSE56檢驗程序驗證(Verification)

未經修改而使用的已確認的檢驗程序在常規使用前，應經過實驗室的獨立驗證。應從制造商或方法開發者處獲得相關信息，以確定檢驗程序的性能特征。進行的獨立驗證，應通過獲取客觀的證據（以性能特征形式）證實檢驗程序的性能與其聲明相符。驗證過程證實的檢驗程序的性能指標，應與檢驗結果的預期用途相關。應將驗證程序制定成文件，并記錄驗證結果。驗證結果應由適當的授權人員審核并記錄審核過程。檢驗程序驗證(Verification)未經修改而使用的已57實驗室應對以下來源的檢驗程序進行確認：（a）非標方法；（b）實驗室設計或制定的方法；（c）超出預期范圍使用的標準方法；（d）修改過的確認方法。方法確認應盡可能全面，并通過客觀的證據（以性能特征形式）證實滿足檢驗預期用途的特定要求。應將確認程序制定成文件，并記錄確認結果。確認結果應由授權人員審核并記錄審核過程。當對確認過的檢驗程序進行變更時，應將改變所引起的影響形成文件，適當時，應重新進行確認。檢驗程序的確認(Validation)

實驗室應對以下來源的檢驗程序進行確認：檢驗程序的確認(Va58測量正確度(measurementtrueness)：測量準確度(measurementaccuracy)：測量精密度（含測量重復性和測量中間精密度,measurementprecision，includingmeasurementrepeatabilityandmeasurementintermediateprecision）：測量不確定度(measurementuncertainty)：分析特異度（含干擾物,analyticalspecificity,includinginterferingsubstances）；分析靈敏度(analyticalsensitivity)：檢出限(detectionlimit)：定量限(quantitationlimit)：測量區間(measuringinterval)：診斷特異度(diagnosticspecificity)：診斷靈敏度(diagnosticsensitivity)：測量正確度(measurementtrueness)：59測量正確度(measurementtrueness)：無窮多次重復測量所得量值的平均值與一個參考量值間的一致程度。注1：測量正確度不是一個量，不能用數值表示。注2：測量正確度與系統測量誤差有關，與隨機測量誤差無關。注3：術語“測量正確度”不能用“測量準確度”表示。反之亦然。測量正確度(measurementtrueness)：60測量準確度(measurementaccuracy)：被測量的測得值與其真值間的一致程度。注1：概念“測量準確度”不是一個量，不給出有數字的量值。當測量提供較小的測量誤差時就說該測量是較準確的。注2：術語“測量準確度”不應與“測量正確度”、“測量精密度”相混淆，盡管它與這兩個概念有關。注3：測量準確度有時被理解為賦予被測量的測得值之間的一致程度。測量準確度(measurementaccuracy)：被測61正確度驗證方法--溯源性方法類：1、決定性方法：與決定性方法檢測結果進行比較而建立；2、參考方法：與參考方法檢測結果進行比較而建立；3、常規方法：與已建立可比性的方法進行結果比較而驗證。物質類：1、標準物質：檢測有證書說明其材料特性的適當參考物質；2、校準品：由供應商或制造商提供溯源性，應有關于試劑、程序或檢驗系統溯源性的聲明文件；3、質控品：經PT，EQA，CAP等活動使用過質控品。正確度驗證方法--溯源性方法類：62第五部分ISO15189對分子診斷檢測的系統完整性要求第五部分63

ABIViiA?7ABI7500LC480CFX96Mx3000pSlan96P激發光源鹵鎢燈鹵鎢燈氙燈LED鹵鎢燈LED檢測器CCD成像系統CCD成像系統CCD成像系統光敏二極管光電倍增管光電傳感器檢測通道6個5個6個5個4-5個4個激發波長450-670nm400-660nm430-630nm450-730nm350-750nm通道1：470nm通道2：530nm通道3：580nm通道4：630nm檢測波長500-720nm500-660nm430-630nm450-730nm350-750nm通道1：510nm；通道2：565nm；通道3：620nm；通道4：665nm支持的熒光染料FAM?、SYBR?、SYTO?9(MeltDoctor?)、Fluorescein、

SYPRO?Orange、VIC?、JOE?、TET?、HEX?、TAMRA?、NED?、BODIPY?TMR-X、ROX?、TexasRed?、LIZ?、AlexaFluor?、Joda-4FAM/SYBRGreen、VIC/JOE、NED/TAMRA/Cy3、ROX/TexasRed、Cy5等，軟件支持ROX校正去除誤差LightCyclerCyan500、YBRGreenI、FAM、HEX,、VIC、LightCyclerRed610、LightCyclerRed640、Cy5FAM、SYBR,、HEX/JOE、ROX、Cy5、TAMRA等SYBRGreenI、FAM、TexasRed、ROX、TET、Cy3、Cy5、HEX、JOE、VIC、TAMRA、ALEXAFluor350等通道1：FAM/SYBRgreenI；

通道2：VIC/HEX/TET/JOE；通道3：TexasRed/ROX；通道4：Cy5國內外主流熒光定量PCR儀器情況簡介

ABIViiA?7ABI7500LC480CFX96Mx64國內市場上主要使用的乙肝試劑情況

圣湘羅氏達安科華凱杰方法學一步法磁珠法磁珠法煮沸法柱提法煮沸法煮沸法目的基因檢測熒光FAMFAMFAMFAMFAMFAMFAM內標檢測熒光HEXHEXVIC無VIC無VIC靈敏度（IU/ml）1001019500100500500線性范圍（IU/ml）500~5×10920~2×10920~1.7×1081×103~1×108250~5×108500~1×1081×103~5×107重復性好好好較差一般較差較差抗干擾能力較強強較強一般一般一般一般ROX熒光校正有有無無無無有操作簡便性簡便一般自動化，復雜一般復雜一般一般國內市場上主要使用的乙肝試劑情況

圣湘羅氏達安科華凱杰方法學65

圣湘達安科華凱杰方法學磁珠法酚-氯仿抽提法柱提法柱提法目的基因檢測熒光FAMFAMFAMFAM內標檢測熒光HEX無無VIC靈敏度（IU/ml）25定性檢測5001000線性范圍（IU/ml）50~1×108定性檢測1×103~1×1071×103~1×107重復性好較差一般一般抗干擾能力強弱一般一般ROX熒光校正有無無有操作簡便性簡便復雜復雜復雜國內市場上主要使用的丙肝試劑情況

圣湘達安科華凱杰方法學磁珠法酚-氯仿抽提法柱提法柱提法目的66醫學實驗室量值溯源的要求CNAS承認的檢定證書/校準報告包括：（1）國家計量主管部門承認的；（2）衛生醫藥行業主管部門承認的；（3）CNAS認可或互認的校準機構出具的；（4）設備制造商提供的。CNAS承認的標準物質/標準樣品包括：（國家標準物質網）（1）國家計量和標準化主管部門承認的；（2）衛生醫藥行業主管部門承認的；（3）CNAS認可或互認的標準物質/標準樣品生產者（RMP）提供的；（4）設備制造商提供的。實驗室應提供溯源到更高等級、國家或國際計量基準/參考方法的有效證據。當以上溯源方式不可行或不適用時，評審組應要求實驗室提供確保檢驗結果可靠性的相關證據。來自2012年12月1日B版“醫學實驗室質量和能力認可評審工作指導書”醫學實驗室量值溯源的要求CNAS承認的檢定證書/校準報告包括67醫學實驗室量值溯源的要求醫學實驗室測量結果溯源性的要求：評審組應評價醫學實驗室測量結果的溯源性滿足CNAS-CL06：2014《測量結果的溯源性要求》的情況，并參考CNAS-GL18《量值溯源要求在醫學測量領域的實施指南》。應要求實驗室提供溯源到更高等級、國家或國際計量基準/參考方法的有效證據。當溯源不可行或不適用時，評審組應要求實驗室提供確保檢驗結果可靠性的相關證據。來自2014年5月1日B版第1次修訂“醫學實驗室質量和能力認可評審工作指導書”醫學實驗室量值溯源的要求醫學實驗室測量結果溯源性的要求：68根據計量可追溯至SI的可能性及測量程序和校準品的不同計量水平的可用性，有如下五種典型的計量溯源鏈的上端。（1)測量結果可以在計量上溯源至SI的量。有可用的一級參考測量程序和一個或多個（經承認的）一級參考物質（用作校準品）。達到這樣水平的有約25～30個類型的量，具有良好確定的組分，如：一些電解質、代謝物、甾體激素和一些甲狀腺激素。在醫學實驗室提供的常規結果中，這些量占較大部分。（2）有可用的國際約定的參考測量程序（不能稱為一級參考測量程序）和一個或多個由此程序賦值的國際約定校準物。如HbA1C（糖化血紅蛋白）即是符合該情況的量的組分。（3）有可用的國際約定的參考測量程序，但沒有國際約定校準物質。符合該情況約有30種類型組分的量，如：凝血因子。（4）有可用的一個或多個定值國際約定校準物（用作校準品）和定值方案，但沒有國際約定參考測量程序。符合該情況的量約有300多種如使用世界衛生組織（WHO）國際標準的量，如蛋白類激素、某些抗體和腫瘤標記物。（5）既無參考測量程序又無用作校準的參考物質。制造商自行建立“自用”測量程序和校準品，為產品校準品定值。符合該情況的約有300種組分的量，如抗體和腫瘤標記物和抗體等。來自CNAS-GL18《量值溯源要求在醫學測量領域的實施指南》根據計量可追溯至SI的可能性及測量程序和校準品的不同計量水69第六部分分子診斷設備制造商在幫組用戶通過ISO15189認可過程中應注意的問題第六部分70為什么核酸檢測容易出問題?實驗前影響因素及對策實驗中影響因素及對策實驗后影響因素及對策如何做好室內質控為什么核酸檢測容易出問題?71實驗前因素,包括廠家產品設計,生產,運輸,保存過程中的質量保障,客戶使用前對產品的存放,質檢.實驗中因素,包括操作中人為因素和配套相關儀器,操作方法本身缺陷等.實驗后因素,包括不同儀器廠家分析軟件自身設計計算方法(方差法,二次相乘法)的不同和人為的調節方法.PCR常見問題分類實驗前因素,包括廠家產品設計,生產,運輸,保存過程中的質量保72陰性樣本出現微弱擴增曲線(假陽性)，運輸保存不當產品完全失效(假陰性)，探針熒光強度隨氣溫升高而降低。原因分析:試劑盒生產、運輸、保存過程由于溫度上升發生非特異擴增。長時間高溫會導致Taq酶失活，導致試劑盒完全失效。廠家對策:對于會發生非特異結合和擴增的組分盡可能分開包裝，避免在客戶進行實驗前就發生非特異性擴增。盡可能在運輸過程中保證冷鏈，核酸產品發貨使用干冰包裝。

使用熱啟動Taq酶等新技術,使試劑盒常溫穩定性大大提高，如37°c存放24小時不影響擴增質量。客戶對策:收貨,保存時盡可能多注意，嚴格使用室內質控。常見實驗前問題及對策陰性樣本出現微弱擴增曲線(假陽性)，運輸保存不當產品完全失效73常見實驗中問題及對策一個好的方法，本身應該盡可能減少對客戶操作水平的要求。實際情況:實驗中會碰到各式各樣的假陽性假陰性結果。一定要重視對配套儀器的校正工作：PCR擴增儀、離心機、干浴器、移液器。嚴格按照說明書操作,盡可能使用風險較低的方法學：應特別注意試劑與儀器的配套性問題。抽提標準品,內標能明顯提升可靠性。常見實驗中問題及對策一個好的方法，本身應該盡可能減少對客戶操74核酸檢測前的標本處理——核酸提取臨床標本：血漿、血清、分泌物拭子等裂解：使用化學試劑或物理方法破碎病毒外殼釋放核酸分離純化：使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質、鹽及其它雜質徹底分離的過程，避免這些雜質對后續擴增檢測的影響RNA容易降解，對DNA和RNA病毒的核酸提取方法有較大差異核酸提取是臨床核酸檢測中手工操作介入最多，影響最大的步驟核酸檢測前的標本處理——核酸提取臨床標本：血漿、血清、分泌物75對分子診斷設備的要求及應用中的問題-發送版-課件761、熒光定量PCR試劑的發展趨勢及要求煮沸法等方法學提升試劑盒的性能，實現靈敏度高、線性范圍寬、特異性好、可重復性好的熒光定量PCR檢測操作實現自動化、檢測實現個體化拓展臨床應用領域，發揮分子診斷更早、更特異、更本質的優勢，推動分子診斷技術的普及2、熒光定量PCR儀的發展趨勢及要求多通道，至少擁有雙通道檢測（FAM和VIC），實現臨床對目的基因和內標的雙重檢測；高通量，滿足臨床檢測發展的需求；易操作，軟件界面應該容易設置和操作，減輕臨床檢測工作負擔；應用廣，能實現定性、定量、基因表達、溶解曲線等多種實驗的檢測；穩定性好，正常操作情況下儀器的故障率應該盡可能小，保證臨床檢測工作的正常運行；易維護，提高臨床使用的適應性。熒光定量PCR儀器與試劑發展趨勢及要求1、熒光定量PCR試劑的發展趨勢及要求熒光定量PCR儀器與試77謝謝！shenzuojun@163.com謝謝！shenzuojun@163.com78ISO15189認可對分子診斷設備

的要求及應用中的問題沈佐君shenzuojun@163.comISO15189認可對分子診斷設備

的要求及應用中的問題沈佐79主要內容一、開展分子診斷檢測的國家及行業相關規定二、開展分子診斷檢測涉及的主要設備三、ISO15189在分子診斷領域的應用說明簡介四、ISO15189對分子診斷設備的性能要求五、ISO15189對分子診斷檢測的系統完整性要求六、分子診斷設備制造商在幫組用戶通過ISO15189認可過程中應注意的問題主要內容一、開展分子診斷檢測的國家及行業相關規定80第一部分開展分子診斷檢測的國家及行業相關規定第一部分81分子診斷的基本概念基因體外擴增檢驗，通常稱為PCR檢驗2002-2009年:該檢驗項目是目前我國臨床檢驗項目中唯一一項需要通過衛生部或省級臨床檢驗中心現場技術驗收合格方可開展臨床檢驗的技術準入項目。2009年5月1日后：衛生部關于印發《醫療技術臨床應用管理辦法》的通知（衛醫政發〔2009〕18號）和《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號）。分子診斷的基本概念82醫療技術分為三類：第一類：醫療技術是指安全性、有效性確切，醫療機構通過常規管理在臨床應用中能確保其安全性、有效性的技術。第二類：醫療技術是指安全性、有效性確切，涉及一定倫理問題或者風險較高，衛生行政部門應當加以控制管理的醫療技術。（如PCR）第三類：醫療技術是指具有下列情形之一，需要衛生行政部門加以嚴格控制管理的醫療技術：（1）涉及重大倫理問題；（2）高風險；（3）安全性、有效性尚需經規范的臨床試驗研究進一步驗證；（4）需要使用稀缺資源；（5）衛生部規定的其他需要特殊管理的醫療技術。（共19項，第8項基因芯片診斷技術，現劃為第二類）醫療技術分為三類：83衛生部負責第三類醫療技術的臨床應用管理工作。第三類醫療技術目錄由衛生部制定公布，并根據臨床應用實際情況，予以調整。省級衛生行政部門負責第二類醫療技術臨床應用管理工作。第二類醫療技術目錄由省級衛生行政部門根據本轄區情況制定并公布，報衛生部備案。衛生部負責第三類醫療技術的臨床應用管理工作。84醫療技術臨床應用

能力審核屬于第三類的醫療技術首次應用于臨床前，必須經過衛生部組織的安全性、有效性臨床試驗研究、論證及倫理審查。

第二類醫療技術和第三類醫療技術臨床應用前實行第三方技術審核制度。

對醫務人員開展第一類醫療技術臨床應用的能力技術審核，由醫療機構自行組織實施，也可以由省級衛生行政部門規定。

衛生部指定或者組建的機構、組織（以下簡稱技術審核機構）負責第三類醫療技術臨床應用能力技術審核工作（1.中國醫學科學院、2.中華醫學會、3.中國醫院協會、4.中華醫師協會、5.中華口腔醫學會）。

省級衛生行政部門指定或者組建的技術審核機構負責第二類醫療技術臨床應用能力技術審核工作。

衛生部可以委托省級衛生行政部門組織對指定的第三類醫療技術進行臨床應用能力技術審核工作。醫療技術臨床應用能力審核85對開展分子診斷檢測實驗室的要求：實驗室流程布局人員上崗證書實驗室的管理（參照ISO17025，10章38款）規范的應該是：實驗室驗收合格證書（技術審核報告）+衛生行政部門的登記（診療科目）對開展分子診斷檢測實驗室的要求：86第二部分開展分子診斷檢測涉及的主要設備第二部分87主要設備（5.5檢驗過程）1、核酸提取儀2、PCR

（1）普通PCR儀（2）實時熒光PCR儀

（3）液體芯片3、雜交儀4、基因芯片5、一體化/工作站6、測序儀主要設備（5.5檢驗過程）88輔助設備（5.2設施和環境條件）1、加樣器2、金屬浴3、離心機4、冰箱5、生物安全柜6、UPS7、純水器（能除RNA酶）輔助設備（5.2設施和環境條件）89第三部分ISO15189在分子診斷領域的應用說明簡介：5.2、5.3、5.5及附錄第三部分90醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明

CNAS-CL36

2014年4月21日第一次修訂，2014年11月1日實施醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明

CNA911范圍本文件規定了CNAS對分子診斷領域的認可要求，包括：病原體核酸和人體基因等領域涉及的核酸擴增試驗、雜交試驗（包括解剖病理中的原位雜交試驗）、核酸電泳分析等。

注：“分子診斷”包括檢驗醫學領域的“分子檢驗”以及病理學檢查領域的“分子病理”。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改單）適用于本文件。GB/T20468-2006臨床實驗室定量測定室內質量控制指南CNAS-RL02能力驗證規則CNSA-CL31內部校準要求臨床技術操作規范·病理學分冊醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則病理科建設與管理指南（試行），衛辦醫政發〔2009〕31號3術語和定義1范圍92標本接收與處理：流程和標本是否合格的要點試劑耗材質檢：為何要質檢、如何做核酸提取：原理和操作技術要領防污染：措施和意識質量控制：程序和實際運行情況、失控的分析處理結果分析與判斷：結果審核、報告發放評審中考核的主要內容標本接收與處理：流程和標本是否合格的要點評審中考核的主要內容935.2設施和環境條件

5.2.1

應實施安全風險評估，如果設置了不同的控制區域，應制定針對性的防護措施及合適的警告。5.2.2涉及基因擴增檢驗的實驗室原則上分四個獨立的工作區域：試劑貯存和準備區；樣品制備區；擴增區；擴增產物分析區。如使用自動分析儀（擴增產物閉管檢測），擴增區和擴增產物分析區可合并。具體實驗室分區應依據其所使用的技術平臺及檢驗項目和工作量而定。

上述每個區域應有充足空間以保證：樣品處置符合分析前、后樣品分區放置；儀器放置符合維修和操作要求；樣品制備區放置生物安全柜、離心機和冰箱等儀器設備；打印檢驗報告時交叉污染的控制。5.2設施和環境條件5.2.1應實施945.2設施和環境條件工作區域應符合如下要求：c）實驗室各分區應配置固定和移動紫外線燈，波長為254nm，照射時離實驗臺的高度一般為60～90cm；e）樣品制備區應配置二級生物安全柜和洗眼器，實驗室附近應有噴淋裝置。所有分子病理實驗室均應設置獨立的標本前處理區，包括切片區和脫蠟區，用于組織切片、脫蠟、水化、染色等。脫蠟、水化及染色應在通風設施中進行。5.2設施和環境條件工作區域應符合如下要求：955.2設施和環境條件5.2.3用以保存臨床樣品和試劑的設施應設置目標溫度和允許范圍，并記錄。實驗室應有溫度失控時的處理措施并記錄。5.2.6不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。工作結束后應立即對工作區進行清潔，必要時進行消毒及去污染。

應依據所用分析設備和實驗過程的要求，制定環境溫濕度控制要求并記錄。應有溫濕度失控時的處理措施并記錄。

擴增儀應配備不間斷電源（UPS）；

應依據用途（如：RNA檢測用水），制定適宜的水質標準（如：應除RNase），并定期檢測。

分子檢驗各工作區域應有明確的標記。進入基因擴增實驗室各工作區應按照單一方向進行，即試劑貯存和準備區→樣品制備區→擴增區→擴增產物分析區。不同的工作區域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區域時，不應將工作服帶出。5.2設施和環境條件5.2.3用以保存臨床樣品和試劑的設施965.3實驗室設備、試劑和耗材

如從事RNA檢測，宜配備－70℃的冷凍設備。需要時，配備高速冷凍離心機。標本制備區使用的一次性加樣器吸頭應帶有濾芯。PCR試驗用容器應可密閉，不同工作區域內的設備、物品不能混用。組織標本前處理區的設備通常應包括切片機、裱片機、切片刀、電熱恒溫箱、脫蠟缸、水化缸及HE染色缸等。5.3實驗室設備、試劑和耗材如從事RNA檢測975.3實驗室設備

應按國家法規要求對強檢設備進行檢定。應進行外部校準的設備，如果符合檢測目的和要求，可按制造商校準程序進行。應至少對分析設備的加樣系統、檢測系統和溫控系統進行校準（適用時）。分析設備和輔助設備的內部校準應符合CNAS-CL31《內部校準要求》。ABI5700FAM?/SYBR?GreenI，VIC?/JOE?，NED?/TAMRA?/Cy3?，ROX?/Texas-Red?和Cy5?應定期對基因擴增儀、加樣器、溫度計、恒溫設備、離心機和生物安全柜等進行校準。5.3實驗室設備應按國家法規要求對強檢設備98樣本升降溫速率：快速模式：－1.6-＋0.8℃/秒

標準模式：±1.6℃/秒加熱塊最高升降溫速率：2.5℃/秒溫度范圍：4℃-100℃溫度精度：設置值/顯示溫度的±0.25℃(35℃至95℃)(時鐘啟動后3分鐘開始測量)溫度均一性：±0.5℃(35℃至95℃)(時鐘啟動后30秒開始測量)光學系統：五色激發光濾光片，五色發射光濾光片和CCD成像系統安裝時已校準染料：SYBR?GreenI，FAM?，VIC?，JOE?，NED?，TAMRA?，ROX?，Texas

Red?，Cy3?，Cy5?。被動參照染料：ROX?樣本升降溫速率：快速模式：－1.6-＋0.8℃/秒995.3實驗室設備

設備故障后，應首先分析故障原因，如果設備故障可能影響了方法學性能，故障修復后，可通過以下合適的方式進行相關的檢測、驗證：(a)可校準的項目實施校準驗證，必要時，實施校準；(b)質控物檢驗；(c)與其他儀器或方法比對，偏差符合附錄A.3的要求；(d)以前檢驗過的樣品再檢驗，偏差符合附錄A.5的要求。5.3實驗室設備設備故障后，應首先分析1005.3實驗室設備

實驗室應建立試劑和關鍵耗材（如離心管、帶濾芯的吸頭）的驗收程序，相應程序中應有明確的判斷符合性的方法和質量標準（宜參考附錄A）。

實驗室應對新批號或同一批號不同貨運號的試劑和關鍵耗材進行驗收，驗收試驗至少應包括：外觀檢查：肉眼可看出的，如包裝完整性、有效期等；性能驗證：通過實驗才能判斷的，如試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率、試劑的批間差異、關鍵耗材的抑制物等。5.3實驗室設備實驗室應建立試劑和關鍵耗材1015.3實驗室設備

試劑性能驗證記錄應能反映該批試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率。一般情況下，臨床實驗室在新批號試劑或關鍵耗材使用前，應驗證試劑批間差異和耗材的抑制物，符合附錄A.6要求即可視為滿足要求。特殊情況下，如實驗室懷疑提取試劑有質量問題，可采用凝膠電泳試驗比較核酸提取物與核酸標準物確認核酸片段提取的完整性、260nm紫外波長測定確認核酸提取的產率、260nm/280nm比值確認核酸提取的純度。5.3實驗室設備試劑性能驗證記錄應能反102靶核酸提取的質量純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標準比較測定。核酸提取的產率：可在A260讀數測定。核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用已知病原體含量的溶血和/或脂血標本用待評價試劑提取，然后進行擴增檢測，比較所得到的結果。靶核酸提取的質量純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的103用于定性檢驗的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進行試劑批號驗證。用于定量檢驗的試劑，應進行新舊試劑批間的差異驗證，方法和要求參照附錄A.6要求。耗材的抑制物驗收：對關鍵耗材應檢測是否存在核酸擴增的抑制物，方法和要求參照附錄A.6要求。5.3實驗室設備用于定性檢驗的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進行試劑批號驗證。104試劑質檢

強調采用患者標本進行試劑質檢的意義：PCR實驗時兩個關鍵步驟：（1）從標本中提取核酸；（2）提取核酸的擴增。商品化的質控品和標準曲線的結果良好，并非能反映提取試劑的質量。試劑質檢強調采用患者標本進行試劑質檢的意義：105推薦的試劑質檢方案標本選擇：一般選擇已用老試劑測定過的患者標本5份，其中一份陰性，其余4份一般要盡可能涵蓋高、中、低、臨界等濃度差。結果判斷：用新試劑重復測定上述5份標本，計算偏差(%)；判斷標準(根據實驗室室內質控RCV和能力驗證允許總誤差TEa)；關注臨界值和高值！推薦的試劑質檢方案標本選擇：一般選擇已用老試劑測定過的患者標1065.5檢驗過程

定量檢測方法和程序的分析性能驗證內容至少應包括精密度、正確度、線性、測量和/或可報告范圍、抗干擾能力等。定性檢測項目驗證內容至少應包括測定下限、特異性、準確度（方法學比較或與金標準比較）、抗干擾能力等。驗證結果應經過授權人審核。應使用驗證過的核酸抽提和純化方法，必要時進行核酸定量。5.5檢驗過程定量檢測方法和程序的分析107

對產前檢驗，在完成分子診斷前應保留備份培養物并跟蹤監測實驗的準確性；在檢驗胎兒標本前，應檢驗父母一方或雙方的突變狀態，宜由同一實驗室檢驗；如有足夠的標本，應從兩份不同標本中提取DNA進行雙份檢驗。實驗室應了解檢驗方法受母體細胞污染的影響，應有程序評估并減少這種影響。

應有明確和統一的原位雜交（ISH）陽性信號的標準，并建立本實驗室的陽性閾值。組織病理ISH，應結合組織形態進行結果判讀，并采用國際通用的評分標準。5.5檢驗過程對產前檢驗，在完成分子診斷前應保留備份培養1085.6檢驗結果質量的保證

總則應制定室內質量控制程序，定量測定可參照GB/T20468-2006《臨床實驗室定量測定室內質量控制指南》。質量控制程序中應有針對核酸檢測防污染的具體措施。應保留DNA質量評價記錄。需要時，應對RNA的質量進行評價，并選擇合適的“管家”mRNA作為內對照以評價所提取RNA的完整性，并保留RNA質量評價記錄及假陰性率監測記錄。對用于基因突變檢測的石蠟包埋樣品，應有病理醫師從組織形態學對腫瘤細胞的存在與否及其數量進行評價，并決定是否需要對腫瘤細胞進行富集。當分子診斷結果與臨床和其他實驗結果不符時，應記錄并分析原因，適當時采取糾正措施。5.6檢驗結果質量的保證總則1095.6檢驗結果質量的保證

質控物定性檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和/或陽性質控物。如為基因突變、基因多態性或基因型檢測，則應包括最能反映檢測情況的突變或基因型樣品，每批檢測的質控至少應有一種基因突變或基因型。定量檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和陽性質控物。5.6檢驗結果質量的保證質控物1105.6檢驗結果質量的保證

質控數據質控規則應確保試驗的穩定性和檢驗結果的可靠性。定量檢測項目：控圖應包括質控結果、質控物名稱、濃度、批號和有效期、質控圖的中心線和控制界線、分析儀器名稱和唯一標識、方法學名稱、檢驗項目名稱、試劑和校準物批號、每個數據點的日期和時間、干擾行為的記錄、質控人員及審核人員的簽字、失控時的分析處理程序和糾正措施等。定性檢測項目：陰陽性符合預期。5.6檢驗結果質量的保證質控數據1115.6檢驗結果質量的保證

通過與其他實驗