第3章動物細胞與組織培養動物的細胞與組織培養

定義：從動物體內取出組織或細胞，模擬機體內生理環境，在體外建立無菌、適當溫度和一定營養條件下，使之生存和生長，并維持其結構和功能的方法。1動物細胞培養群體培養（massculture）：將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層克隆培養（clonalculture）：培養高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。群體培養（左）和克隆培養（右）

DefinitionsofTissueCultureTerms

cellculture-themaintenanceandgrowingofdispersedcellsoutsidetheorganism.Secondaryculture－Cellstakenfromaprimarycultureandpassedordividedinvitro.Thesecellshavealimitednumberofdivisionsorpassages.tissueculture-themaintenanceofatissueorfragmentinawaythatmayallowdifferentiationandpreservationofthearchitectureand/orfunction

monolayer-singlelayerofcellsgrowingonasurfaceorganculture-maintenanceoftissues,wholeorpartsoforgansinawaythatmayallowdifferentiationandpreservationofthearchitectureand/orfunctionexplant-anexcisedfragmentofanorganwhichusuallyretainssomedegreeoftissuearchitecture原代培養（primaryculture）：即細胞或組織離開機體后的首次培養。primaryculture-startedfromcells,tissuesororganstakendirectlyfromananimal傳代（passage）：培養的細胞生長到一定的密度后轉移到新的容器中培養或需要更換到新的培養液稱為傳代或傳代培養。subculture-thetransplantationofcellsfromoneculturetoanother(passaging)細胞系（cellline）：原代培養物經首次傳代成功后即成細胞系，由原先存在于原代培養物中的細胞世系所組成。如果不能繼續傳代或傳代數有限，可稱為有限細胞系。如果可以連續傳代則稱為連續細胞株原代培養細胞成功傳代即為細胞系。cellline-arisesfromtheprimarycultureatthetimeofthefirstsubculture-"finite"lifespancontinuouscellline-acelllinewhichhasbeen"transformed"-"infinite"lifespan細胞株（cellstrain）：從培養細胞中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群。克隆（clone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。2發展歷史動物細胞（組織）培養技術起源于19世紀所應用的某些胚胎學技術。動物細胞（組織）培養的奠基人是美國生物學家Harrison。在1907年采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養法將蛙胚的神經組織培養在淋巴液中，保持存活了幾周時間，并觀察到細胞突起的生長過程。Harrison--isolatedpiecesoffrogembryonictissueknowntogiverisetonervefibres-grewtheminfroglymph-observedoutgrowthofaxonsoverperiodofweeksin1907.

法國學者Carrel功不可沒。他1923年設計的卡氏培養瓶，用雞胚抽提液培養心肌組織取得成功并維持34年之久,特別注意到實驗中的無菌操作。表三、實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞HenriettaLacksBHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin19513應用領域生產單克隆抗體和疫苗。組織與器官再生、培養。動物細胞基因工程動物細胞培養生產的生物制品

（1）病毒疫苗：乙肝疫苗(HbsAg)、脊髓灰質炎疫苗(Polio)、狂犬疫苗(Rabies)等。（2）非抗體免疫調節劑：干擾素（IFN）、白細胞介素（IL）、B細胞生長因子（BCGF）、巨噬細胞激活因子（MAN）T細胞替代因子（TRF）等。（3）多肽生長因子：神經生長因子（NGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）、血清生長因子（SF）等。（4）酶類：組織血纖維溶酶原激活劑（t－PA）等。（5）激素：紅細胞生成素（EPO）、促黃體生成素（LH）、促濾胞素（FSH）等。（6）腫瘤特異性抗原：癌胚抗原（CEA）等。（7）

單克隆抗體（MCAB）。（8）病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。（9）皮膚移植：單細胞培養等。3.1.1動物細胞的特點問題一與微生物、植物細胞相比，動物細胞有哪些特殊之處？

動物細胞與微生物細胞相比，主要有以下不同：

（1）動物細胞比微生物細胞大，無細胞壁。（2）動物細胞倍增時間長，生長緩慢，易受污染。（3）培養過程需氧量少，對機械攪拌或剪切力敏感。（4）動物細胞間主要以聚集體形式存在。（5）原代細胞一般繁殖50代左右即退化死亡。3.1.2體外培養

原代培養（亦稱初代培養）傳代培養（亦稱繼代培養）。PrimaryCultureretentionofthe3Dshapeoutgrowthandmigrationofcells3.1.3動物細胞（組織）培養的生長特性

體外培養細胞類型1粘附型細胞anchorage－dependent

粘附生長是大多數有機體細胞在體內生存和生長發育的基本存在方式。粘附有兩種含義：一是細胞之間相互接觸；二是細胞與細胞外基質結合。動物細胞培養中，大多數哺乳動物細胞是必須附壁即附著在固體表面生長，當細胞布滿表面后即停止生長，這時若取走一片細胞，存留在表面上的細胞就會沿著表面生長而重新布滿創面,稱為單層附壁培養。細胞貼壁延展過程Contactinhibition

Whencellscontacteachother,theyceasetheirgrowth.CellsarrestinG0phaseofthecellcycle.

Transformedcellswillcontinuetoproliferateandpileupeachother.

體外培養細胞類型（形態）

1成纖維型2上皮型3游走型4多形型

（一）成纖維細胞型細胞

Fibroblast

外形與體內成纖維細胞形狀相似，細胞大致呈梭形或不規則形。前者貼壁后呈長梭形，圓形細胞核位于中央，胞質外伸出2－3個長短不同的突起，生長時呈放射狀、漩渦狀走向。多數細胞之間排列疏散，有較大的細胞間隙。有時也相互平行排列，成群細胞呈現放射狀、旋渦狀等形式。心肌，平滑肌、血管內皮細胞的體外培養常呈此類型。（二）上皮型細胞

Epithelialcell類似上皮細胞的細胞，特點是：扁平狀，形態較為規則，細胞貼壁后呈三角形及不規則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長時彼此緊密連接成單層細胞。因為相互擁擠而呈現“鋪路石狀”。皮膚的表皮細胞、消化道與呼吸道的上皮細胞、肺泡上皮細胞、消化腺上皮細胞、血管內皮細胞等，Hela（三）游走型細胞

wandering分散生長，一般不連接成片形成群落；細胞胞質常伸出偽足和突起；在培養器皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運動，速度快且方向不規則。該類細胞不穩定，外形不規則且不斷變化，當細胞密度增大、連接成片時，形狀類似于成纖維樣細胞型或上皮細胞型。表現這種細胞形態的主要是單核巨噬細胞系統的細胞，如顆粒性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、某些腫瘤細胞等。（四）多形型細胞

Polymorphic多形型細胞是一些形態上不規則的細胞。多形型細胞不常見，只有某些像神經組織細胞等難以確定其穩定形態的，才可歸于多形細胞。體外培養呈現多形型細胞的細胞最常見的是神經元和神經膠質細胞。影響細胞形態的因素能夠影響細胞形態學特征的主要因素包括：血清成分、培養基成分及添加成分、培養基的酸堿度、氣相環境、溫度等。例如，一些已分化的細胞在有無血清的培養液中生長，形態特征就會有所差異。形態會因條件而改變（來源、生長條件和功能狀態不同）。

2非粘附型細胞（懸浮型細胞）

體外生長不貼壁，可在培養液中懸浮生長，因此也叫懸浮型細胞。一些在體內原本就以懸浮狀態生長的細胞或微生物，當接種于體外環境中也可以以懸浮狀態生長。血液白細胞、淋巴組織細胞，某些腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等都屬此類細胞。這類細胞形態學特點是胞體始終為球形。懸浮培養類似微生物的深層培養。由于是懸浮生長，細胞密度一般都較高，培養的效率也高、操作也容易。這種方法有多方面的優越性，易于大規模生產，便于過程的控制。可惜能在懸浮狀態下生長的細胞種類有限，且不太方便觀察。

3.2動物細胞培養

的基本技術

3.2.1體外培養的條件

3.2.1.1與微生物細胞培養相比動物細胞培養的特殊性大多數哺乳動物細胞只有附著在固體或半固體的表面才能生長。動物細胞對于營養要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清。對于培養環境的適應性更差，對環境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需嚴格監控。動物細胞生長緩慢，因此培養時間較長。對環境的影響又比微生物為大，因此常用空氣、氧、二氧化碳和氮的混合氣體進行供氧和調節pH。培養條件TemperaturepHDissolvedgasNutrients培養基20世紀40年代以后，從事動物組織培養的各國科學家把研究的重點集中在培養基的改造上。1951年，Earle等人開發了供動物細胞體外培養的培養基。MediaThechoiceofmediaiscelltypespecificandoftenempirical-no"allpurpose"medium.Shouldprovide:nutrients,bufferingcapacity,isotonic,andbesterile天然培養基動物血清、組織提取液、雞胚胎提取液等優點：營養價值高缺點：成分復雜、來源有限、成本較高小（胎）牛血清——蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素、多種生長因子等成分。合成培養基Earle于1951年首次使用。優點：成分已知、易控制缺點：無法替代一些未知成分解決途徑——合成培養基中添加小牛血清，彼此互補無血清培養基血清培養基的優點：含有豐富的利于細胞生長的成分血清培養基缺點：對后期產物的分離、提純及檢測造成干擾。來源有限、成本較高無血清培養基：試圖全部替代血清成分，尤其是生長因子（例如胰島素）、激素（例如生長激素）等。

培養過程圖解細胞系生長過程的3個主要階段

（一）原代（初代）培養期指從體內取出組織接種培養到第一次傳代培養這個階段，一般持續1-4周。在這個階段，細胞比較活躍，有細胞分裂，但不旺盛。組織和細胞剛離體，生物學特性變化不大，具有二倍體遺傳特性，最接近和反映體內生長特性，很適合做藥物測試，細胞分化等實驗研究。（二）傳代期原代培養細胞一經傳代后便稱為細胞系，在全生命期中該階段的持續時間最長。一般情況下，當傳代10-50次后，細胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。

（三）衰退期該階段細胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。