NY/T××××—××××PAGE1DB1307張家口市市場監(jiān)督管理局發(fā)布2022-XX-XX實施2022-XX-XX發(fā)布母DB1307張家口市市場監(jiān)督管理局發(fā)布2022-XX-XX實施2022-XX-XX發(fā)布母驢人工授精技術規(guī)程（征求意見稿）DB1307/TXXX—2022張家口市地方標準ICS65.020.30CCSB43DB1307/TXXX—2022PAGE6前言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由張家口市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件起草單位：陽原縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，張家口桑陽牧業(yè)有限公司。本文件主要起草人：曾申明，龐潔，沈學梅，王海麗，韓海軍，武開，閆冬梅，肖江龍，王佳敏，白海賓，祁建平，賈建平，李靖，李楠。母驢人工授精技術規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了母驢人工授精的發(fā)情鑒定，精液準備，人工授精，妊娠診斷，數(shù)據(jù)記錄的操作技術要求。本文件適用于張家口地區(qū)內驢規(guī)模養(yǎng)殖場，其他養(yǎng)殖場可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB15/T2151-2021驢人工授精技術規(guī)程NY/T1335-2007牛人工授精技術規(guī)程GB/T39171-2020廢塑料回收技術規(guī)范3母驢的發(fā)情鑒定3.1試情法挑選體質健壯、性欲旺盛的種公驢進行試情。牽拉種公驢在母驢圈舍外部通道走動，或者拴系在母驢圈內的柱樁上。處于發(fā)情期的母驢表現(xiàn)出愿意接近公驢，并有弓腰舉尾、陰唇閃合、頻繁排尿、后肢張開、兩耳向頸部收攏、口部頻繁開合等行為；未發(fā)情母驢則躲避公驢，甚至在公驢靠近時，有蹴踢和啃咬等抗拒行為。3.2B超直腸發(fā)情鑒定3.2.1所需設備及試劑B超儀、一次性長臂手套、潤滑劑、噴漆、促排卵藥物、注射器3.2.2母驢的發(fā)情鑒定將待檢母驢用保定欄固定后，操作者清洗手臂，戴上一次性長臂手套并抹上潤滑劑，在母驢后方將手握成錐形緩慢插入肛門。若直腸內有糞便可用手清出，待直腸內部干凈且直腸壁舒緩時，將手臂深入觸摸卵巢。然后，將B超探頭握在手心，平行并緊貼直腸壁下緣，依次檢查母驢子宮體、子宮角和卵巢卵泡發(fā)育狀態(tài)。母驢發(fā)情階段一般分為以下四個階段：間情期：卵泡上有多個小卵泡、直徑為10-20mm；子宮角和子宮體回聲均勻，沒有液體存留；此階段母驢陰道干澀，不接受爬跨，抗拒直腸檢查。發(fā)情前期：卵巢上出現(xiàn)優(yōu)勢卵泡，體積增加較快，卵泡內充滿液體，卵泡直徑一般為20-30mm；子宮角出現(xiàn)水腫，陰道有少量稀薄粘液流出；部分母驢出現(xiàn)發(fā)情行為，表現(xiàn)為接近公驢，少部分出現(xiàn)母驢典型的發(fā)情特征--口部反復開合、兩耳向頸部收攏。發(fā)情期：優(yōu)勢卵泡快速生長，直徑達到30mm以上，此時母驢出現(xiàn)明顯的發(fā)情行為，主動接近公驢、接受爬跨、頻繁排尿，口部反復開合、兩耳向頸部收攏；子宮角水腫明顯。發(fā)情后期：卵泡破裂排卵，檢查時可見明顯黃體，母驢性情逐漸安靜；子宮角水腫消失。3.2.3發(fā)情母驢的處理診斷結束后，準確記錄母驢的卵泡、子宮和黃體狀態(tài)，利用噴漆在母驢后背標記卵泡發(fā)育情況，挑選出優(yōu)勢卵泡直徑在30mm以上的母驢，注射l.0ml的GnRH類似物或2000IU人絨毛膜促性腺激素（hCG）以促進排卵，優(yōu)勢卵泡直徑在35mm的母驢在當天下午輸精，而優(yōu)勢卵泡直徑在30-35mm的母驢在第二天下午進行輸精。4精液準備4.1所需設備及試劑一次性長臂手套、顯微鏡、計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA系統(tǒng)）、量筒、溫度計、恒溫水浴鍋、假陰道、集精杯、稀釋液、潤滑劑、高壓蒸汽滅菌鍋、精液分裝瓶、燒杯、毛巾、溫水、新潔爾滅消毒液、酒精、紗布、20mL注射器、載玻片、蓋玻片。4.2采精前準備4.2.1稀釋液的準備在發(fā)情鑒定當天，按照發(fā)情母驢的數(shù)量準備稀釋液，力求新鮮。稀釋液配好后要進行滅菌，然后在4℃保存。在采精前半小時，將稀釋液置于37℃水浴鍋中預熱待用。4.2.2采精器具的準備采精所用的器具及相關用品，都應提前清洗消毒。安裝假陰道時，應將內胎兩頭翻轉套在外殼的兩端，并用橡膠圈加以固定，然后用70%酒精對內部進行消毒，放入35℃恒溫箱中備用。4.2.3發(fā)情母驢的準備挑選一頭發(fā)情母驢，要求性情溫順，將母驢牽到采精大廳拴系在欄柱上，用清水沖洗母驢臀部和外陰部，可收集發(fā)情母驢尿液以刺激公驢性欲。4.3精液采集4.3.1假陰道的準備預先向安裝好的假陰道夾層中灌入40-42℃的熱水，灌注量以假陰道夾層體積的2/3為宜，到采精時假陰道內溫度應為38℃左右。假陰道內腔壓力主要靠充氣來調節(jié)，可根據(jù)采精公驢陰莖大小進行調整，假陰道在灌水充氣后，內胎呈“Y”型，入口為較淺的漏斗狀為宜。采精前將潤滑劑均勻涂抹在假陰道入口至內胎1/3深處，或者采精前用精液稀釋液沖洗。4.3.2公驢外生殖器的清洗待公驢陰莖勃起后。用0.1%高錳酸鉀溶液擦洗陰莖及包皮，再用無菌溫水沖洗，最后用滅菌紗布或紙巾擦干。4.3.3精液采集采精時，采精員右手持假陰道把柄處，將假陰道靠在右臂肘處，當公驢爬跨時，立即站立于母驢右后側，迅速將陰莖導入假陰道內。一般情況下陰莖插入假陰道后經(jīng)幾次抽動即可射精，射精后順勢使陰莖從假陰道中退出，將假陰道的集精杯端緩慢下傾，并打開活塞放氣，迅速將精液送入精液處理室進行品質鑒定和稀釋。4.4精液品質鑒定精液品質鑒定要求在37℃條件下進行，檢查操作要迅速、輕緩，不能人為損壞精子，取樣要均勻，評定結果要準確而客觀。4.4.1精液體積將集精杯中的精液沿裝有三層專用濾紙漏斗一側，緩緩倒入帶刻度的無菌量筒中，以去除精液中的灰塵和雜質等。然后，讀取量筒的數(shù)值，記錄精液體積。射精量因品種及個體不同而有很大差異，一般約為30-150mL。4.4.2顏色驢精液在正常情況下為乳白色或灰白色，精子密度越高顏色越深，反之越淺。精液若出現(xiàn)紅色、綠色、黃褐色等異常顏色，不能用于輸精。4.4.3氣味新鮮公驢精液略帶腥味，出現(xiàn)濃烈刺鼻性氣味的精液不能用于輸精。4.4.4密度利用血球計數(shù)板結合稀釋倍數(shù)計算精液密度，也可以用CASA系統(tǒng)直接測定。4.4.5活力（直線前進運動率）精液分析需在按裝37℃恒溫臺的顯微鏡上進行，統(tǒng)計視野下直線前進運動的精子占總精子數(shù)的比例，至少需要統(tǒng)計三個不同視野的數(shù)值，然后取平均數(shù)，也可以用CASA系統(tǒng)直接測定。精子活力在70%以上的精液才可用于輸精。4.4.6畸形率公驢精液一般每一個月需要檢查一次畸形率。精液與姬姆薩溶液或藍墨水混合后在載玻片上涂片，等風干后，在顯微鏡下統(tǒng)計形態(tài)異常精子占總精子數(shù)的比例，至少需要統(tǒng)計三個不同視野的數(shù)值，然后取平均數(shù)，也可以用CASA系統(tǒng)直接測定。精子畸形率不超過15%的精液才可用于輸精。4.5精液稀釋精液采集后，立即將精液等量倒入50mL離心管中，配比平衡后，放入普通醫(yī)學離心機，在室溫條件下，1000xg,離心10min。離心結束后，去除上清液至剩余體積約5mL左右。根據(jù)輸精母驢數(shù)和總精子數(shù)，確定稀釋倍數(shù)（每個輸精劑量為10mL，其中至少含有10億個精子）。然后，緩慢加入預熱的稀釋液，在稀釋過程中輕輕搖勻，防止局部過度稀釋導致的精子凝集。在稀釋后，緩慢將離心管顛倒3-5次，使精子和稀釋液充分混勻，混勻后再測一次精子活力，確保精子活力沒有下降。最后，分裝到輸精瓶或無膠塞的一次性塑料注射器中，即可進行輸精。注意：在整個處理和運輸過程中，防止劇烈震蕩而導致的精子畸形率上升。5輸精輸精應在專門的配種室進行。發(fā)情母驢在保定后，將尾部纏繞吊起，掏除直腸里的宿糞。先用含中性皂液的清水洗滌母驢外陰部糞污，再用清水沖洗，擦干后用碘伏消毒，準備輸精。輸精管可以用牛輸精腔外套或豬子宮深部輸精軟管，要求無菌。輸精時，輸精員站在母驢后側，右手并攏呈錐形，將輸精管尖端夾持于食指與中指間，手心略向左下方伸入陰道，并緩慢向前觸摸子宮頸口，用拇指輕輕捅開子宮頸，順勢將輸精管插入子宮頸內約10cm處，擠壓精液分裝軟瓶或推動注射器，將精液緩慢注入子宮內，然后拉出輸精管，并輕輕按摩子宮頸，防止精液回流。母驢在輸精后48h需要檢查排卵狀況，如果沒有排卵還需要再輸精一次，直至排卵。6妊娠鑒定妊娠鑒定在輸精后的第21天進行，妊娠鑒定時將待檢母驢保定，利用直腸B超檢查子宮體、子宮角和卵巢，操作方法同母驢發(fā)情鑒定。妊娠母驢卵巢上有黃體，處于游離狀態(tài)的胚胎在B超儀上顯示為黑色圓球，并在子宮腔內游離，已附植的胚胎在B超儀顯示為黑色囊泡，胎兒為白色懸掛于子宮內壁。7數(shù)據(jù)記錄詳細記錄母驢的卵泡發(fā)育情況、公驢精液品質及配種妊娠等情況，記錄格式參見附錄A。附錄A(資料性附錄)A.1母驢發(fā)情檢查與配種記錄記錄表的格式見表A.1。表A.1母驢發(fā)情檢查與配種記錄表日期序號耳號卵巢子宮情況輸精施用藥物下次檢查時間其他左側右側公驢號劑量時間名稱劑量12A.2公驢精液采集與處理記錄記錄表的格式見表A.2。表A.2公驢精液處理與輸精記錄表采精日期序號耳號射精量精子密度活力畸形率稀釋倍