第四章檸檬酸發酵機制

檸檬酸又名枸櫞酸，學名α-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產物之一。

性質：分子式C6H8O7，分子量192.12

有兩種形式水合物：100℃時融解，密度1.542g/cm3(18℃)

無水物：無色晶體或粉末，熔點153℃

有強酸味。溶于水、乙醇和乙醚

第四章檸檬酸發酵機制檸檬酸又名枸櫞酸，學1

用途：1）食品行業2）醫藥行業3）化工行業4）其它行業

檸檬酸的生產：1874年首次從檸檬汁中提出檸檬酸并結晶成固體；1913年首次實現利用黑曲霉發酵生成檸檬酸。用途：2一、檸檬酸合成途徑葡萄糖丙酮酸檸檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EMP途徑氧化脫羧羧化一、檸檬酸合成途徑葡萄糖丙酮酸檸檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EM3

1953年，Jagnnathan等證實了黑曲霉中存在EMP途徑的所有酶；

1954年，Shu提出葡萄糖分解代謝中約80％走EMP途徑；

1958年，MeDomough等發現黑曲霉還存在HMP途徑的酶，但HMP途徑主要存在于孢子形成階段；1954－1955年，Ramakrishman和Martin研究發現黑曲霉中存在三羧酸循環；1953年，Jagnnathan等證實了黑4淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富馬酸CO2Fe2+CO2CO2淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮5存在兩個CO2固定系統（需Mg2＋、K＋）：1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更強）2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸存在兩個CO2固定系統（需Mg2＋、K＋）：6碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途徑2ADP2ATP2H29ADP9ATP2×C3H4O3丙酮酸脫羧CO2固定C4C2縮合H2O3/2O23H2OC6H8O7檸檬酸碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途徑2ADP2ATP2H7（一）、糖酵解及丙酮酸代謝的調節1、正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、無機磷、銨離子對該酶則有激活作用，特別是還能解除檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用。銨離子濃度與檸檬酸生成速度有密切關系，正是由于細胞內濃度升高，使磷酸果糖激酶對細胞內積累的大量檸檬酸不敏感。二、檸檬酸生物合成的代謝調節（一）、糖酵解及丙酮酸代謝的調節二、檸檬酸生物合成的代謝調節8淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸檸檬酸CO2CO2CO2NH4+PiK+AMPATP淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮92.比較底物錳充足、錳缺乏時分批培養物的最大活力時發現，錳缺乏時黑曲霉的組成（合成）代謝受損傷，這與檸檬酸的積累有關。錳缺乏時，細胞內NH4＋濃度高，Aa濃度高（蛋白合成受阻，導致升高）。因此，錳離子效應是通過NH4＋升高而減少檸檬酸對磷酸果糖激酶的抑制來實現的。2.比較底物錳充足、錳缺乏時分批培養物的最大活力時發現，錳缺103.丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個調節點，在某些真菌得到證實，但黑曲霉未被證實。3.丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個調節點，在某些真菌得到證實11（二）TCA循環的調節

1、TCA環的起始酶：檸檬酸合成酶是一種調節酶。但在黑曲霉中，檸檬酸合成酶沒有調節作用，這是黑曲霉TCA環的第一個特點。順烏頭酸酶失活，阻斷TCA環是檸檬酸積累的必要條件，順烏頭酸水合酶需要Fe2＋。順烏頭酸酶、異檸檬酸酶在pH2.0時失活，線粒體順烏頭酸酶在催化時有檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7的平衡，這個平衡可能就是造成檸檬酸的最初積累而使pH值降低。（二）TCA循環的調節122.第二個特點：黑曲霉菌體內α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低（TCA環被阻斷），它被葡萄糖和NH4＋抑止

。（是TCA循環中唯一不可逆的反應步驟）3.氧和pH值對檸檬酸發酵的影響很大。氧是發酵過程（EMP途徑和丙酮酸脫氫）生成的NADH2重新氧化時所需標準呼吸鏈產生ATP積累，側呼吸鏈不產生ATP，缺氧導致側呼吸鏈失活，使ATP積累，檸檬酸積累減少。2.第二個特點：黑曲霉菌體內α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低13磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富馬酸CO2Fe2+CO2CO2抑制α-酮戊二酸脫氫酶系磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異14TCA循環在檸檬酸積累中所起作用可歸納為：（1）大量生成草酰乙酸是積累檸檬酸的關鍵（2）丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶基本上不受代謝調節的控制或其控制及微弱，而且這兩個反應的平衡保證了草酰乙酸的提供，增加了檸檬酸的合成能力TCA循環在檸檬酸積累中所起作用可歸納為：（1）大量生成草酰15（3）TCA循環的阻斷微弱，導致循環中間代謝物積累。由于各種酶處于平衡狀態，使檸檬酸積累，當檸檬酸濃度超過一定水平時，就通過抑止異檸檬酸脫氫酶活力來提高自身的積累。（3）TCA循環的阻斷微弱，導致循環中間代謝物積累。由16檸檬酸的積累機制歸納：①Mn抑制蛋白合成NH4解除磷酸果糖激酶的代謝調節，促進EMP途徑的暢通有一條呼吸活力強的不產生ATP的側系呼吸鏈②由于丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調節控制。2+﹢缺乏檸檬酸的積累機制歸納：①Mn抑制蛋白合成NH4解除磷酸果糖激17

③丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA和CO2固定兩個反應的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調節，增強了合成檸檬酸的能力。

④由于順烏頭酸水合酶在催化時建立了以下平衡：檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7同時控制Fe2+含量時，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。

③丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA和CO2固定兩個反應的平衡，18⑤隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，更有利于檸檬酸的積累及排出細胞外。⑤隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時，使順烏頭酸酶和異檸檬19三、乙醛酸循環和醋酸發酵檸檬酸丙酮酸脫羧反應是不可逆的，草酰乙酸的供給只能由乙醛酸循環來完成存在異檸檬酸裂解酶，合成檸檬酸的C4二羧酸只能由乙醛酸提供。三、乙醛酸循環和醋酸發酵檸檬酸丙酮酸脫羧反應是不可逆的，草酰20乙醇乙酸乙酰CoACoA烴類β-氧化草酰乙酸檸檬酸異檸檬酸琥珀酸乙醛酸乙酰CoA蘋果酸富馬酸乙醛酸循環乙醇乙酸乙酰CoACoA烴類β-氧化草酰乙酸檸檬酸異檸檬21作業：簡述檸檬酸生物合成的代謝調節

作業：22第四章檸檬酸發酵機制

檸檬酸又名枸櫞酸，學名α-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產物之一。

性質：分子式C6H8O7，分子量192.12

有兩種形式水合物：100℃時融解，密度1.542g/cm3(18℃)

無水物：無色晶體或粉末，熔點153℃

有強酸味。溶于水、乙醇和乙醚

第四章檸檬酸發酵機制檸檬酸又名枸櫞酸，學23

用途：1）食品行業2）醫藥行業3）化工行業4）其它行業

檸檬酸的生產：1874年首次從檸檬汁中提出檸檬酸并結晶成固體；1913年首次實現利用黑曲霉發酵生成檸檬酸。用途：24一、檸檬酸合成途徑葡萄糖丙酮酸檸檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EMP途徑氧化脫羧羧化一、檸檬酸合成途徑葡萄糖丙酮酸檸檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EM25

1953年，Jagnnathan等證實了黑曲霉中存在EMP途徑的所有酶；

1954年，Shu提出葡萄糖分解代謝中約80％走EMP途徑；

1958年，MeDomough等發現黑曲霉還存在HMP途徑的酶，但HMP途徑主要存在于孢子形成階段；1954－1955年，Ramakrishman和Martin研究發現黑曲霉中存在三羧酸循環；1953年，Jagnnathan等證實了黑26淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富馬酸CO2Fe2+CO2CO2淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮27存在兩個CO2固定系統（需Mg2＋、K＋）：1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更強）2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸存在兩個CO2固定系統（需Mg2＋、K＋）：28碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途徑2ADP2ATP2H29ADP9ATP2×C3H4O3丙酮酸脫羧CO2固定C4C2縮合H2O3/2O23H2OC6H8O7檸檬酸碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途徑2ADP2ATP2H29（一）、糖酵解及丙酮酸代謝的調節1、正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、無機磷、銨離子對該酶則有激活作用，特別是還能解除檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用。銨離子濃度與檸檬酸生成速度有密切關系，正是由于細胞內濃度升高，使磷酸果糖激酶對細胞內積累的大量檸檬酸不敏感。二、檸檬酸生物合成的代謝調節（一）、糖酵解及丙酮酸代謝的調節二、檸檬酸生物合成的代謝調節30淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸檸檬酸CO2CO2CO2NH4+PiK+AMPATP淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮312.比較底物錳充足、錳缺乏時分批培養物的最大活力時發現，錳缺乏時黑曲霉的組成（合成）代謝受損傷，這與檸檬酸的積累有關。錳缺乏時，細胞內NH4＋濃度高，Aa濃度高（蛋白合成受阻，導致升高）。因此，錳離子效應是通過NH4＋升高而減少檸檬酸對磷酸果糖激酶的抑制來實現的。2.比較底物錳充足、錳缺乏時分批培養物的最大活力時發現，錳缺323.丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個調節點，在某些真菌得到證實，但黑曲霉未被證實。3.丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個調節點，在某些真菌得到證實33（二）TCA循環的調節

1、TCA環的起始酶：檸檬酸合成酶是一種調節酶。但在黑曲霉中，檸檬酸合成酶沒有調節作用，這是黑曲霉TCA環的第一個特點。順烏頭酸酶失活，阻斷TCA環是檸檬酸積累的必要條件，順烏頭酸水合酶需要Fe2＋。順烏頭酸酶、異檸檬酸酶在pH2.0時失活，線粒體順烏頭酸酶在催化時有檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7的平衡，這個平衡可能就是造成檸檬酸的最初積累而使pH值降低。（二）TCA循環的調節342.第二個特點：黑曲霉菌體內α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低（TCA環被阻斷），它被葡萄糖和NH4＋抑止

。（是TCA循環中唯一不可逆的反應步驟）3.氧和pH值對檸檬酸發酵的影響很大。氧是發酵過程（EMP途徑和丙酮酸脫氫）生成的NADH2重新氧化時所需標準呼吸鏈產生ATP積累，側呼吸鏈不產生ATP，缺氧導致側呼吸鏈失活，使ATP積累，檸檬酸積累減少。2.第二個特點：黑曲霉菌體內α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低35磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富馬酸CO2Fe2+CO2CO2抑制α-酮戊二酸脫氫酶系磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異36TCA循環在檸檬酸積累中所起作用可歸納為：（1）大量生成草酰乙酸是積累檸檬酸的關鍵（2）丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶基本上不受代謝調節的控制或其控制及微弱，而且這兩個反應的平衡保證了草酰乙酸的提供，增加了檸檬酸的合成能力TCA循環在檸檬酸積累中所起作用可歸納為：（1）大量生成草酰37（3）TCA循環的阻斷微弱，導致循環中間代謝物積累。由于各種酶處于平衡狀態，使檸檬酸積累，當檸檬酸濃度超過一定水平時，就通過抑止異檸檬酸脫氫酶活力來提高自身的積累。（3）TCA循環的阻斷微弱，導致循環中間代謝物積累。由38檸檬酸的積累機制歸納：①Mn抑制蛋白合成NH