毛細管電泳技術及應用毛細管電泳技術及應用1電泳

在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同，可實現分離。

1808年，Reuss（俄國）首次發現電泳現象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白質混合液的分離：

發現樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學獎；電泳在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在2經典電泳

利用電泳現象對某些化學或生物物質進行分離分析的方法和技術叫電泳法或電泳技術。

按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發生了根本變革，迅速發展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術——毛細管電泳。經典電泳利用電泳現象對某些化學或生物物質進行分離分析3毛細管電泳（CapillaryElectrophoresis,CE）高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進：采用了25-100μm內徑的毛細管；采用了高達數千伏的電壓。毛細管的采用使產生的熱量能夠較快散發，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，毛細管電泳的柱效遠高于HPLC，理論塔板數高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數百萬。毛細管電泳（CapillaryElectrophoresi4分離過程

電場作用下，毛細管柱中出現：電泳現象和電滲流現象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

陽離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；

中性粒子無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反。ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。分離過程電場作用下，毛細管柱中出現：電泳現象和電滲流現象。5毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內分離36種無機及有機陰離子，4.1min內分離了24種陽離子；3.操作方便、消耗少

進樣量極少，水介質中進行；4.應用范圍極廣有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學、醫學、藥學、化學、環境保護、材料等；

毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化6一、CE基本原理二、電滲現象與電滲流electroosmoticflow三、影響電滲流的因素四、淌度mobility五、CE中的參數與關系式六、影響分離效率的因素毛細管電泳理論基礎一、CE基本原理毛細管電泳理論基礎7毛細管電泳(CE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關？當帶電離子以速度ν在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(對于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態動力學半徑；η—介質的粘度；)毛細管電泳(CE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中8所以，遷移速度：（球形離子）

物質離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。淌度μ

：單位電場強度下的平均電泳速度。

q—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；γ—離子的表觀液態動力學半徑η—介質的粘度；所以，遷移速度：（球形離子）物質離子在電場中9電滲現象與電滲流

electroosmosisandelectroosmoticflow1.電滲流現象

當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當液體兩端施加電壓時，就會發生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現象叫電滲現象。

電滲現象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

電滲現象與電滲流

electroosmosisande102.HPCE中的電滲現象與電滲流

石英毛細管柱，內充液pH>3時，表面電離成-SiO-,管內壁帶負電荷，形成雙電層。

在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度ν電滲流。2.HPCE中的電滲現象與電滲流石英毛細管柱，內充113.CE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。即

ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質及雙電層的Zeta電勢，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數；ε—介電常數；ξ—毛細管壁的Zeta電勢。

ν電滲流=ε0εξ

E實際電泳分析，可在實驗測定相應參數后，按下式計算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細管有效長度；teo—電滲流標記物（中性物質）的遷移時間。3.CE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度12CE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的性質：內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向負極；內表面帶正負電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向正極；石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：

（1）毛細管改性表面鍵合陽離子基團；

（2）加電滲流反轉劑內充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向正極。CE中電滲流的方向電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的134.CE中電滲流的流形

電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小）；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。4.CE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流145.CE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；ν0=ν電滲流中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結果的重現性；在CE中，控制電滲流非常重要。5.CE中電滲流的作用電滲流的速度約等于一般離子電泳15CE中影響電滲流的因素1.電場強度的影響

電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細管材料的影響

不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產生的電滲流大小不同；CE中影響電滲流的因素1.電場強度的影響2.毛細管材料163.電解質溶液性質的影響（1）溶液pH的影響對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩定。（2）陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。3.電解質溶液性質的影響（1）溶液pH的影響17毛細管電泳技術及應用課件184.溫度的影響毛細管內溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產生的熱量；CE中的焦耳熱與背景電解質的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質溶液黏度變化2%～3%；4.溫度的影響毛細管內溫度的升高，使溶液的黏度下降195.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。

（3）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。5.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，20淌度Mobility

淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；

淌度不同是電泳分離的基礎。1.絕對淌度(absolutemobility)μab無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強度下的平均遷移速度，簡稱淌度。可在手冊中查閱。2.有效淌度(effectivemobility)μef實際溶液中的淌度(實驗中測定的)。μef=∑aiμi

ai—溶質i的解離度；μi—溶質i在解離狀態下的絕對淌度淌度Mobility淌度：帶電離子在單位電場下21CE中的參數與關系式

1.遷移時間（保留時間）

CE兼具有電化學的特性和色譜分析的特性。有關色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細管總長度；2.分離效率（塔板數）

在CE中，僅存在縱向擴散，σ2=2Dt

擴散系數小的溶質比擴散系數大的分離效率高，分離生物大分子的依據。CE中的參數與關系式1.遷移時間（保留時間）V—外加223.分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：3.分離度影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細23影響分離效率的因素—區帶展寬1.縱向擴散的影響

在HPCE中，縱向擴散引起的峰展寬：σ2=2Dt由擴散系數和遷移時間決定。大分子的擴散系數小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據。2.進樣的影響

當進樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向擴散。分離效率明顯下降；理想情況下，進樣塞長度：

Winj=(24Dt)1/2實際操作時進樣塞長度小于或等于毛細管總長度的1%～2%。影響分離效率的因素—區帶展寬1.縱向擴散的影響243.焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產生的焦耳熱可由下式計算：m—電解質溶液的摩爾電導；I—工作電流：cm—電解質濃度；

散熱過程中，在毛細管內形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導致區帶展寬。改善方法：（1）減小毛細管內徑；（2）控制散熱；3.焦耳熱與溫度梯度的影響電泳過程產生的焦耳熱可由254.溶質與管壁間的相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質、多肽帶電荷數多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴重，是目前分離分析該類物質的一大難題。細內徑毛細管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質吸附的機會。減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強電解質，兩性離子一端帶正電，另一端帶負電，帶正電一端與管壁負電中心作用，濃度約為溶質的100-1000倍時，抑制對蛋白質吸附，又不增加溶液電導，對電滲流影響不大。4.溶質與管壁間的相互作用存在吸附與疏水作用，造成265.其他影響因素

（1）電分散作用對譜帶展寬的影響當溶質區帶與緩沖溶液區帶的電導不同時，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質溶液。（2）“層流”現象對譜帶展寬的影響一般情況下，CE中不存在層流，但當毛細管兩端存在壓力差時，出現拋物線形的層流；

產生的原因：毛細管兩端液面高度不同。實際操作時，保持毛細管兩端緩沖溶液平面高度相同。5.其他影響因素（1）電分散作用對譜帶展寬的影響27一、高效毛細管電泳儀二、流程與主要部件三、進樣方式四、檢測器毛細管電泳儀一、高效毛細管電泳儀毛細管電泳儀28毛細管電泳技術及應用課件29儀器流程與主要部件

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21mol/L）儀器流程與主要部件電壓：0～30kV；301.高壓電源（1）0～30kV穩定、連續可調的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統；（4）電壓穩定性：0.1%；（5）電源極性易轉換；2.毛細管柱

（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差；（2）規格：內徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m1.高壓電源（1）0～30kV穩定、連續可調的直流電源；313.緩沖液池

化學惰性，機械穩定性好；4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數據采集與計算機數據處理一體化；

類型檢測限/mol特點紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；3.緩沖液池化學惰性，機械穩定性好；類型32CE具體操作步驟：毛細管電泳的基本步驟包括清洗毛細管、更換電泳緩沖液、進樣、電泳并同時在線檢測。1).清洗毛細管對于一根新的或久未使用的毛細管，需用1mol/L的NaOH溶液、0.1mol/LNaOH溶液、超純水依次清洗。在有些情況下還需用0.1mol/LHCl、甲醇或去垢劑清洗,強堿溶液可以清除吸附在毛細管內壁的油脂、蛋白質等，強酸溶液可以清除一些金屬或金屬離子，甲醇、去垢劑可去除疏水性強的雜質。CE具體操作步驟：33

在進行每次分析前可用相當于毛細管總體積2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為2~3min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結果的重復性。在進行每次分析前可用相當于毛細管總體積2~3倍的34

2).更替電泳緩沖液在進行每次分析前可用相當于毛細管總體積2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為2~3min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結果的重復性。上一步清洗過程結束后，毛細管和電極從清洗液中移至電泳緩沖液，不可避免地將強堿或強酸等溶液帶至其中。緩沖液本身也會因揮發、電泳等而改變其離子強度。因此對于精確分析，每分析五次后需更換一次樣品盤中的緩沖液。一般分析，半天更換一次即可。2).更替電泳緩沖液353）毛細管電泳的進樣方式

進樣量：毛細管長度的1%-2%；nL級、非常小；1.流體力學進樣方式

（1）進樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進樣3）毛細管電泳的進樣方式

進樣量：毛細管長度的1%-36

毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進樣方式

進樣不均：電歧視現象，淌度大的離子比淌度小的進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；

特別適合黏度大的試樣；3.擴散進樣試樣通過擴散作用進入分離柱端口處。毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進樣方式37Buffer:50mMphosphate–TEA(pH2.5)with4.0%HP-β-CD(w/v)and50%methanol;Appliedpotential:30kV;Sample:1mg/Lpropranololdissolvedin(A)(B)water,(C)methanol;(A)Pressureinjection0.5psi.,5s,(B)(C)electrokineticinjection10kV,5s.

CABEffectofinjectionmodeBuffer:50mMphosphate–TEA(38(A)ConditioningofthecapillarywithalowpHbuffercontainingCTAB,andinjectionofalongwaterplugintothecapillarybypressure;(B)Field-amplifiedinjectionofcationsandstackingontheboundaryofwaterplugandtheBGS,whileremovingofthewaterplugoutofthecapillary;(C)Separationvoltageisapplied.TheenantiomerscomplexwithCDandareseparated,andtherestofwaterplugisremoved.SchematicdiagramstheFAEP(A)Conditioningofthecap39分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；根據試樣性質不同，采用不同的分離類型；每種機理的選擇性不同；分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；40一、毛細管區帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應用廣的分離模式；一、毛細管區帶電泳

capillaryzoneelect41二、毛細管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質、DNA等的電荷/質量比與分子大小無關，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。二、毛細管凝膠電泳

capillarygelelect42

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。三、膠束電動毛細管色譜（MEKC）

Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃43

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；

5.色譜與電泳分離模式的結合。3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長；4.可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν44

1.根據等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術；2.毛細管內充有兩性電解質（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（6～8V）時，管內將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；四、毛細管等電聚焦

Capillaryisoelectricfocusing，CIEF1.根據等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術45

4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質帶而相互分離；

5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細管內分離后的溶液推出經過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移46

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2.負離子分析時，前導電解質的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。五、毛細管等速電泳

Capillaryisotachophoresis，CITP1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛47

3.不同離子的淌度不同，所形成區帶的電場強度不同(ν=μE)，淌度大的離子區帶電場強度小；沿出口到進口，將不同區帶依次排序1、2、3、4電場強度依次增大。假設“2”號中離子擴散到“3”號，該區電場強度大，離子被加速，返回到“2”區；當“2”號中離子跑到“1”號區，離子被減速使之歸隊；4.特點：界面明顯，富集、濃縮作用；capillaryisotachophoresis，CITP3.不同離子的淌度不同，所形成區帶的電場強度不同(ν=48

在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲泵”取代機械泵，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程。六、毛細管電動色譜

Capillaryelectrokineticchromatography，CEC在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲49七、毛細管微乳電動色譜

(Microemulsionelectrokineticchromatography,

MEEKC)

Watern-OctaneSO3-SO3-

OH

OHOHOH

OHNa+Na+WaterNa+SO3-WaterButan-1-olSDSSodiumionOH七、毛細管微乳電動色譜

(Microemulsionele50CE相關技術1.毛細管電泳柱技術毛細管是CE的核心部件之一．早期研究集中在毛細管直徑、長度、形狀和材料方面，目前集中在管壁的改性和各種柱的制備。

CE相關技術511)動態修飾毛細管內壁

管壁改性主要是消除吸附和控制電滲流，通常采用動態修飾和表面涂層兩類方法。動態修飾采用在運行緩沖液中加入添加劑，如加入陽離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)，能在內壁形成物理吸附層，使EOF反向．添加劑還有聚胺、聚乙烯亞胺(PEI)等，甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層。

1)動態修飾毛細管內壁522)毛細管內壁表面涂層

涂層方法有很多種，包括物理涂布、化學涂層。最常用的方法是采用雙官能團的偶聯劑，如各種有機硅烷，第一個官能團(如甲氧基)與管壁上的游離羥基進行反應，使其與管壁進行共價結合，再用第二個官能團(如乙烯基)與涂漬物(如聚丙烯酰胺)進行反應，形成一穩定的涂層．此外還有將纖維素、PEI和聚醚組成多層涂層，親水性的絨毛涂層(fuzzy)和聯鎖聚醚涂層。2)毛細管內壁表面涂層53化學鍵合物理吸附化學鍵合物理吸附543)凝膠柱和無膠篩分

CGE的關鍵是毛細管凝膠柱的制備，常用聚丙烯酰胺凝膠栓來進行DNA片段分析和測序。測定蛋白質和肽的分子量常用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-LPAGE)。如將聚丙烯胺單體溶液中的交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)濃度降為零，得到線性非交聯的親水性聚合物用作操作溶液，仍有按分子大小分離的作用，稱無膠篩分。此法簡單，使用方便，分離能力比CGE差。3)凝膠柱和無膠篩分554)CEC的毛細管柱制備

包括開管和填充柱

開管柱：鍵合色譜涂層毛細管柱，例如：將核糖核酸酶、己糖激酶、腺苷脫氨酶等固定到毛細管表面，構成一開管反應器，再和CE連接，可進行核酸選擇性檢測、微量在線合成和分離寡核昔酸等工作。

填充柱：可將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細管中。4)CEC的毛細管柱制備562.毛細管電泳檢測技術

CE對檢測器靈敏度要求相當高，故檢測是CE中的關鍵問題。迄今為止除了原子吸收光譜與紅外光譜末用于CE外，其它檢測手段均已用于CE。現選擇重要的幾類檢測器介紹其最新進展。2.毛細管電泳檢測技術571)紫外檢測器(UV)

在合適位置除去涂層，將透明部分對準光路。UV檢測器集中在提高靈敏度，可采用毛細管彎折、吹泡技術擴大光路。或采用平面積分檢測池，這種設計可使檢測光路增加到1cm。也有用光散射二極管(LEDS)作光源，其線性范圍和信噪比優于汞燈。總體來說進展不大。1)紫外檢測器(UV)582)激光誘導熒光檢測[LIF]

LIF是CE最靈敏的檢測器之一，極大地拓展了CE的應用，DNA測序就須用LIF，單細胞和單分子檢測也離不開LIF。利用CE-LIF技術可檢出染色的單個DNA分子，有望用于癌癥的早期診斷及臨床酶和免疫學檢測等。CE／LIF和微透析結合可測定腦中神經肽。采用波長分辨熒光檢測器可提供有關蛋白和DNA序列的一些結構和動態信息。一些適用于二極管激光器的熒光標記試劑如CY—5等，正在不斷開發和應用。2)激光誘導熒光檢測[LIF]59

CE/LIF向三個方向發展：在原有氦—鎘激光器(325nm)和氬離子激光器(488nm)之外，發展價廉、長波長的二極管激光器；發展更多的熒光標記試劑來擴展應用面；開展更多的應用研究。LIF不但提高了靈敏度，也可增加選擇性，缺點在于被測物須用熒光試劑標記成染色。CE/LIF向三個方向發展：在原有氦—鎘激光器(3603).CE/MS聯用

CE/MS聯用,彌補了CE定性鑒定的不足，故發展特別快。CE/MS聯用主要在兩方面發展：一是各種CE模式和MS聯用，二是CE和各種MS聯用。關鍵是解決接口裝置。最早報道CE/MS聯用是采用單級四極桿質譜，現已發展到三級四極質譜、離子阱質譜等。CE/MS聯用特別適合于復雜生物體系的分離鑒定。因所需樣品少，目前大部分工作集中在基因工程產品和蛋白樣品，CE/MS聯用現在已成為CE研究中的熱點。3).CE/MS聯用614)電化學檢測器（EC）

EC可避免光學類檢測器遇到的光程太短的問題，故和LIF同為CE中靈敏度最高的檢測器。報道最多的是電化學伏安檢測器，常用碳纖維微電極進行單細胞極微量神經遞質(如多巴胺等)的測定。可用脈沖伏安法測定糖、糖肽及金屬離子，也可用循環伏安法，另一類常用的EC為電導檢測器，Li＋的檢測限達10-7mol/L(10-15mol)。4)電化學檢測器（EC）625)化學發光檢測器(CL)

CL具有結構簡單、靈敏度高的特點，近年來引起重視。用CE—CL檢測血紅蛋白，其檢測限比CE—UV低約4個數量級。應用最多的仍是魯米那(luminol)體系，因為該體系對多數待測物如一些金屬離子、氨基酸及其衍生物的檢測靈敏度很高，且反應在水相進行。電致化學發光(ECL)也已成功地用作CE檢測。

5)化學發光檢測器(CL)636)其它檢測器

采用激光作激勵源的除LIF外，還有激光熱透鏡檢測、激光光熱檢測和激光拉曼檢測等。普通熒光檢測器研究集中在開發新的熒光染料，以提高靈敏度。同位素檢測器具有高選擇性和高靈敏度〔可達10-9加mol/L〕，但測定時需經同位素標記步驟，故應用受到限制。6)其它檢測器64

總之，檢測器是CE中具有挑戰性的研究工作。CE/MS聯用是最有應用價值的檢測器，但價格昂貴，不易推廣。發展新型檢測器、提高UV等檢測器靈敏度，以及發展CE和其它分離方法、檢測方法的聯用是CE研究重點之一。總之，檢測器是CE中具有挑戰性的研究工65Lightsource(-)(+)-----------bufferbuffer毛細管電泳—間接紫外檢測法

測定植物中的低分子量有機酸Lightsource(-)(+)b66----------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++EOF-+-------67莧菜根、莖、葉樣品溶液電泳圖1甲酸2蘋果酸3檸檬酸4琥珀酸5戊二酸6未知峰7乙酸莧菜根、莖、葉樣品溶液電泳圖1甲酸68毛細管電泳技術及應用毛細管電泳技術及應用69電泳

在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同，可實現分離。

1808年，Reuss（俄國）首次發現電泳現象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白質混合液的分離：

發現樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學獎；電泳在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在70經典電泳

利用電泳現象對某些化學或生物物質進行分離分析的方法和技術叫電泳法或電泳技術。

按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發生了根本變革，迅速發展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術——毛細管電泳。經典電泳利用電泳現象對某些化學或生物物質進行分離分析71毛細管電泳（CapillaryElectrophoresis,CE）高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進：采用了25-100μm內徑的毛細管；采用了高達數千伏的電壓。毛細管的采用使產生的熱量能夠較快散發，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，毛細管電泳的柱效遠高于HPLC，理論塔板數高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數百萬。毛細管電泳（CapillaryElectrophoresi72分離過程

電場作用下，毛細管柱中出現：電泳現象和電滲流現象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

陽離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；

中性粒子無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反。ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。分離過程電場作用下，毛細管柱中出現：電泳現象和電滲流現象。73毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內分離36種無機及有機陰離子，4.1min內分離了24種陽離子；3.操作方便、消耗少

進樣量極少，水介質中進行；4.應用范圍極廣有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學、醫學、藥學、化學、環境保護、材料等；

毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化74一、CE基本原理二、電滲現象與電滲流electroosmoticflow三、影響電滲流的因素四、淌度mobility五、CE中的參數與關系式六、影響分離效率的因素毛細管電泳理論基礎一、CE基本原理毛細管電泳理論基礎75毛細管電泳(CE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關？當帶電離子以速度ν在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(對于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態動力學半徑；η—介質的粘度；)毛細管電泳(CE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中76所以，遷移速度：（球形離子）

物質離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。淌度μ

：單位電場強度下的平均電泳速度。

q—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；γ—離子的表觀液態動力學半徑η—介質的粘度；所以，遷移速度：（球形離子）物質離子在電場中77電滲現象與電滲流

electroosmosisandelectroosmoticflow1.電滲流現象

當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當液體兩端施加電壓時，就會發生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現象叫電滲現象。

電滲現象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

電滲現象與電滲流

electroosmosisande782.HPCE中的電滲現象與電滲流

石英毛細管柱，內充液pH>3時，表面電離成-SiO-,管內壁帶負電荷，形成雙電層。

在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度ν電滲流。2.HPCE中的電滲現象與電滲流石英毛細管柱，內充793.CE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。即

ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質及雙電層的Zeta電勢，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數；ε—介電常數；ξ—毛細管壁的Zeta電勢。

ν電滲流=ε0εξ

E實際電泳分析，可在實驗測定相應參數后，按下式計算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細管有效長度；teo—電滲流標記物（中性物質）的遷移時間。3.CE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度80CE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的性質：內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向負極；內表面帶正負電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向正極；石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：

（1）毛細管改性表面鍵合陽離子基團；

（2）加電滲流反轉劑內充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向正極。CE中電滲流的方向電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的814.CE中電滲流的流形

電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小）；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。4.CE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流825.CE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；ν0=ν電滲流中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結果的重現性；在CE中，控制電滲流非常重要。5.CE中電滲流的作用電滲流的速度約等于一般離子電泳83CE中影響電滲流的因素1.電場強度的影響

電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細管材料的影響

不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產生的電滲流大小不同；CE中影響電滲流的因素1.電場強度的影響2.毛細管材料843.電解質溶液性質的影響（1）溶液pH的影響對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩定。（2）陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。3.電解質溶液性質的影響（1）溶液pH的影響85毛細管電泳技術及應用課件864.溫度的影響毛細管內溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產生的熱量；CE中的焦耳熱與背景電解質的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質溶液黏度變化2%～3%；4.溫度的影響毛細管內溫度的升高，使溶液的黏度下降875.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。

（3）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。5.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，88淌度Mobility

淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；

淌度不同是電泳分離的基礎。1.絕對淌度(absolutemobility)μab無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強度下的平均遷移速度，簡稱淌度。可在手冊中查閱。2.有效淌度(effectivemobility)μef實際溶液中的淌度(實驗中測定的)。μef=∑aiμi

ai—溶質i的解離度；μi—溶質i在解離狀態下的絕對淌度淌度Mobility淌度：帶電離子在單位電場下89CE中的參數與關系式

1.遷移時間（保留時間）

CE兼具有電化學的特性和色譜分析的特性。有關色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細管總長度；2.分離效率（塔板數）

在CE中，僅存在縱向擴散，σ2=2Dt

擴散系數小的溶質比擴散系數大的分離效率高，分離生物大分子的依據。CE中的參數與關系式1.遷移時間（保留時間）V—外加903.分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：3.分離度影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細91影響分離效率的因素—區帶展寬1.縱向擴散的影響

在HPCE中，縱向擴散引起的峰展寬：σ2=2Dt由擴散系數和遷移時間決定。大分子的擴散系數小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據。2.進樣的影響

當進樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向擴散。分離效率明顯下降；理想情況下，進樣塞長度：

Winj=(24Dt)1/2實際操作時進樣塞長度小于或等于毛細管總長度的1%～2%。影響分離效率的因素—區帶展寬1.縱向擴散的影響923.焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產生的焦耳熱可由下式計算：m—電解質溶液的摩爾電導；I—工作電流：cm—電解質濃度；

散熱過程中，在毛細管內形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導致區帶展寬。改善方法：（1）減小毛細管內徑；（2）控制散熱；3.焦耳熱與溫度梯度的影響電泳過程產生的焦耳熱可由934.溶質與管壁間的相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質、多肽帶電荷數多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴重，是目前分離分析該類物質的一大難題。細內徑毛細管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質吸附的機會。減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強電解質，兩性離子一端帶正電，另一端帶負電，帶正電一端與管壁負電中心作用，濃度約為溶質的100-1000倍時，抑制對蛋白質吸附，又不增加溶液電導，對電滲流影響不大。4.溶質與管壁間的相互作用存在吸附與疏水作用，造成945.其他影響因素

（1）電分散作用對譜帶展寬的影響當溶質區帶與緩沖溶液區帶的電導不同時，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質溶液。（2）“層流”現象對譜帶展寬的影響一般情況下，CE中不存在層流，但當毛細管兩端存在壓力差時，出現拋物線形的層流；

產生的原因：毛細管兩端液面高度不同。實際操作時，保持毛細管兩端緩沖溶液平面高度相同。5.其他影響因素（1）電分散作用對譜帶展寬的影響95一、高效毛細管電泳儀二、流程與主要部件三、進樣方式四、檢測器毛細管電泳儀一、高效毛細管電泳儀毛細管電泳儀96毛細管電泳技術及應用課件97儀器流程與主要部件

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21mol/L）儀器流程與主要部件電壓：0～30kV；981.高壓電源（1）0～30kV穩定、連續可調的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統；（4）電壓穩定性：0.1%；（5）電源極性易轉換；2.毛細管柱

（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差；（2）規格：內徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m1.高壓電源（1）0～30kV穩定、連續可調的直流電源；993.緩沖液池

化學惰性，機械穩定性好；4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數據采集與計算機數據處理一體化；

類型檢測限/mol特點紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；3.緩沖液池化學惰性，機械穩定性好；類型100CE具體操作步驟：毛細管電泳的基本步驟包括清洗毛細管、更換電泳緩沖液、進樣、電泳并同時在線檢測。1).清洗毛細管對于一根新的或久未使用的毛細管，需用1mol/L的NaOH溶液、0.1mol/LNaOH溶液、超純水依次清洗。在有些情況下還需用0.1mol/LHCl、甲醇或去垢劑清洗,強堿溶液可以清除吸附在毛細管內壁的油脂、蛋白質等，強酸溶液可以清除一些金屬或金屬離子，甲醇、去垢劑可去除疏水性強的雜質。CE具體操作步驟：101

在進行每次分析前可用相當于毛細管總體積2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為2~3min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結果的重復性。在進行每次分析前可用相當于毛細管總體積2~3倍的102

2).更替電泳緩沖液在進行每次分析前可用相當于毛細管總體積2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為2~3min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結果的重復性。上一步清洗過程結束后，毛細管和電極從清洗液中移至電泳緩沖液，不可避免地將強堿或強酸等溶液帶至其中。緩沖液本身也會因揮發、電泳等而改變其離子強度。因此對于精確分析，每分析五次后需更換一次樣品盤中的緩沖液。一般分析，半天更換一次即可。2).更替電泳緩沖液1033）毛細管電泳的進樣方式

進樣量：毛細管長度的1%-2%；nL級、非常小；1.流體力學進樣方式

（1）進樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進樣3）毛細管電泳的進樣方式

進樣量：毛細管長度的1%-104

毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進樣方式

進樣不均：電歧視現象，淌度大的離子比淌度小的進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；

特別適合黏度大的試樣；3.擴散進樣試樣通過擴散作用進入分離柱端口處。毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進樣方式105Buffer:50mMphosphate–TEA(pH2.5)with4.0%HP-β-CD(w/v)and50%methanol;Appliedpotential:30kV;Sample:1mg/Lpropranololdissolvedin(A)(B)water,(C)methanol;(A)Pressureinjection0.5psi.,5s,(B)(C)electrokineticinjection10kV,5s.

CABEffectofinjectionmodeBuffer:50mMphosphate–TEA(106(A)ConditioningofthecapillarywithalowpHbuffercontainingCTAB,andinjectionofalongwaterplugintothecapillarybypressure;(B)Field-amplifiedinjectionofcationsandstackingontheboundaryofwaterplugandtheBGS,whileremovingofthewaterplugoutofthecapillary;(C)Separationvoltageisapplied.TheenantiomerscomplexwithCDandareseparated,andtherestofwaterplugisremoved.SchematicdiagramstheFAEP(A)Conditioningofthecap107分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；根據試樣性質不同，采用不同的分離類型；每種機理的選擇性不同；分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；108一、毛細管區帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應用廣的分離模式；一、毛細管區帶電泳

capillaryzoneelect109二、毛細管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質、DNA等的電荷/質量比與分子大小無關，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。二、毛細管凝膠電泳

capillarygelelect110

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。三、膠束電動毛細管色譜（MEKC）

Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃111

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；

5.色譜與電泳分離模式的結合。3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長；4.可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν112

1.根據等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術；2.毛細管內充有兩性電解質（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（6～8V）時，管內將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；四、毛細管等電聚焦

Capillaryisoelectricfocusing，CIEF1.根據等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術113

4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質帶而相互分離；

5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細管內分離后的溶液推出經過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移114

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2.負離子分析時，前導電解質的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。五、毛細管等速電泳

Capillaryisotachophoresis，CITP1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛115

3.不同離子的淌度不同，所形成區帶的電場強度不同(ν=μE)，淌度大的離子區帶電場強度小；沿出口到進口，將不同區帶依次排序1、2、3、4電場強度依次增大。假設“2”號中離子擴散到“3”號，該區電場強度大，離子被加速，返回到“2”區；當“2”號中離子跑到“1”號區，離子被減速使之歸隊；4.特點：界面明顯，富集、濃縮作用；capillaryisotachophoresis，CITP3.不同離子的淌度不同，所形成區帶的電場強度不同(ν=116

在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲泵”取代機械泵，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程。六、毛細管電動色譜

Capillaryelectrokineticchromatography，CEC在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲117七、毛細管微乳電動色譜

(Microemulsionelectrokineticchromatography,

MEEKC)

Watern-OctaneSO3-SO3-

OH

OHOHOH

OHNa+Na+WaterNa+SO3-WaterButan-1-olSDSSodiumionOH七、毛細管微乳電動色譜

(Microemulsionele118CE相關技術1.毛細管電泳柱技術毛細管是CE的核心部件之一．早期研究集中在毛細管直徑、長度、形狀和材料方面，目前集中在管壁的改性和各種柱的制備。

CE相關技術1191)動態修飾毛細管內壁

管壁改性主要是消除吸附和控制電滲流，通常采用動態修飾和表面涂層兩類方法。動態修飾采用在運行緩沖液中加入添加劑，如加入陽離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)，能在內壁形成物理吸附層，使EOF反向．添加劑還有聚胺、聚乙烯亞胺(PEI)等，甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層。

1)動態修飾毛細管內壁1202)毛細管內壁表面涂層

涂層方法有很多種，包括物理涂布、化學涂層。最常用的方法是采用雙官能團的偶聯劑，如各種有機硅烷，第一個