基因工程原理練習題及其答案(完整資料）(可以直接使用，可編輯優秀版資料，歡迎下載）

基因工程復習題基因工程原理練習題及其答案(完整資料）(可以直接使用，可編輯優秀版資料，歡迎下載）題型：名詞解釋(10個）3０分；填空（每空１分）20分；選擇題(每題1分）１0分；簡答題（4個）20分;論述題（2個）20分。第一章緒論1．名詞解釋：基因工程：按照預先設計好的藍圖,利用現代分子生物學技術，特別是酶學技術，對遺傳物質DNA直接進行體外重組操作與改造，將一種生物(供體）的基因轉移到另外一種生物（受體)中去，從而實現受體生物的定向改造與改良。遺傳工程廣義：指以改變生物有機體性狀為目標，采用類似工程技術手段而進行的對遺傳物質的操作,以改良品質或創造新品種。包括細胞工程、染色體工程、細胞器工程和基因工程等不同的技術層次。狹義:基因工程?？寺。簾o性（繁殖）系或純系。指由同個祖先經過無性繁殖方式得到的一群由遺傳上同一的DＮA分子、細胞或個體組成的特殊生命群體。2．什么是基因克隆及基本要點?３。舉例說明基因工程發展過程中的三個重大事件.A）限制性內切酶和ＤＮA連接酶的發現（標志著ＤNA重組時代的開始)；B)載體的使用；C）１９70年,逆轉錄酶及抗性標記的發現。4.基因工程研究的主要內容是什么？基礎研究：基因工程克隆載體的研究基因工程受體系統的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技術的研究應用研究:基因工程藥物研究轉基因動植物的研究在食品、化學、能源和環境保護等方面的應用研究第二章基因克隆的工具酶1.名詞解釋:限制性核酸內切酶：一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內脫氧核糖核酸酶.回文結構：雙鏈DＮＡ中的一段倒置重復序列，當該序列的雙鏈被打開后,可形成發夾結構。同尾酶:來源不同、識別序列不同，但產生相同粘性末端的酶。同裂酶:不同來源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的識別序列黏性末端：DNA末端一條鏈突出的幾個核苷酸能與另一個具有突出單鏈的DNA末端通過互補配對粘合，這樣的DNA末端，稱為粘性末端。平末端:DNA片段的末端是平齊的。限制性核酸內切酶的酶活性單位（U）：在酶的最適反應條件下，在50μｌ容積中,６0分鐘內完全切割１mgｌＤNA所需的酶量為1個酶活性單位（ｕnｉt或Ｕ)限制性核酸內切酶的星活性:指限制性內切酶在非標準條件下，對與識別序列相似的其它序列也進行切割反應,導致出現非特異性的DNA片段的現象。連桿（linkeｒ）：化學合成的8~12個核苷酸組成的寡核苷酸片段.以中線為軸兩邊對稱，其上有一種或幾種限制性核酸內切酶的識別序列,酶切后可產生一定的粘性末端，便于與具有相同粘性末端的另一DNA片段連接。銜接頭(aｄaｐtor）：化學合成的寡核苷酸，含有一種以上的限制性核酸內切酶識別序列。其一端或兩端具有一種或兩種內切酶切割產生的黏性末端。底物位點優勢效應:酶對同一個DＮＡ底物上的不同酶切位點的切割速率不同。激酶：對核酸末端羥基進行磷酸化的酶.2．說明限制性內切核酸酶的命名原則要點。用屬名第一個字母和種名的頭兩個字母組成的３個字母斜體的略語表示寄主菌的物種名以及菌株（型）的代號命名。該菌株（種）中發現的不同的酶按照順序以羅馬字母編號I,IＩ,IＩＩ等.如：Eschｅrｉchiacoli用Eco表示。第四個字母代表菌株或株型、變種名，若酶存在于質粒上，則需大寫字母表示非染色體遺傳因子。例：HindＩII從流感嗜血菌株(ＨaemophilｕsInflｕｅnzuｅ)d株中分離的第三個酶。EcoRI表示基因位于Eschericｈｉａcoli中的抗藥性R質粒上。前三個字母用斜體,其他用正體表示.如果酶存在于一種特殊菌株中,三個字母后加上菌株名稱符號，名稱最后部分往往包含羅馬數字，表示在該特殊菌株中發現這種酶的先后次序。３。引起限制性核酸內切酶星活性的可能因素有哪些？若使用buffer不當,會有sｔarａcｔｉvitｙ，而ｓtaｒａcｔiviｔｙ是指限制酶對所作用的DＮＡ及序列失去專一性，當酶辨認切割位置的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用,而產生錯誤的結果。所以當DNＡ同時以兩種限制酶處理時，選擇可使兩種酶之活性反應均可達75﹪以上的rｅstrictionbuffeｒ，若找不到適當的ｂｕffer則先加低鹽的buffer使其中一酶作用后，在加入高鹽buｆfeｒ使另一酶作用，若無法以鹽的高低分別加入不同的bｕｆfer，則先加入一種bufｆer作用后,加3MNａOAc/95﹪aｌcoｈoｌ沉淀DＮA，再加另一種buffer作用。４．DNA片段之間的連接方式有哪些?具黏性末端的DNA片段之間的連接、具平末端ＤＮA片段之間的連接、DNA片段末端修飾后進行連接、DNA片段加連桿（linker）后的連接。5。什么是Ｋlenoｗ酶？有哪些活性?在基因工程中有什么作用？KlenowDＮA聚合酶是E．cｏliDNＡｐolymｅraseⅠ經蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5’－－3’外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和３'--5’外切活性不受影響。也稱為Kｌｅnoｗ片段（Kｌｅnowｆragment）,或Ｅ．colｉDNA聚合酶Ⅰ大片段。5?￠３￠聚合酶3?￠５￠外切酶無小亞基活性6。DNA聚合酶、RＮA聚合酶、反轉錄酶、末端轉移酶、多核苷酸激酶和堿性磷酸酯酶有哪些主要特性?它們在基因工程中的主要用途分別是什么?第三章基因工程的載體１．名詞解釋：載體：指能夠運載外源DＮＡ片段（目的基因）進入受體細胞,具有自我復制能力，使外源ＤNA片段在受體細胞中得到擴增和表達,不被受體細胞的酶系統所破壞的一類ＤNA分子.克隆載體:用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體.一般具有較低的分子量、較高的拷貝數和松弛型復制子。主要由細菌質?；蚺c其它質粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構建。表達載體：使目的基因在宿主細胞中得以表達的載體.可將重組體DNA導入適合的受體細胞,使所載的目的基因能夠復制、轉錄和翻譯.穿梭載體：稱雙功能載體（bｉfunctionaｌvectｏr）。能在兩種不同的生物體內復制的載體.質粒:指獨立存在于宿主細胞染色體外、能夠自我復制的DNA分子.松弛型質粒：拷貝數多于１0個的質粒。嚴謹型質粒；拷貝數為１至幾個的質粒.接合質粒；指質粒所攜帶的基因的功能是使細胞彼此有效地接觸,以便將質粒DNＡ從供體細胞轉移至受體細胞。如:質粒上的tra基因使宿主細胞（大腸桿菌）產生菌毛,合成細胞表面物質，促使宿主細胞與受體細胞接合.質粒的不親和性;顯性質粒;隱性質粒；質粒的遷移作用;多拷貝質粒；整合質粒;穿梭質粒；表達質粒；探針質粒；pUCl8質粒;pBR322質粒;溶菌生長；溶源生長；原噬菌體；烈性噬菌體；溶原化;柯斯載體或粘粒（coｓｍｉｄ）;cｏs位點；人工染色體2。作為工程載體必備哪些基本條件？3。試述質粒載體、噬菌體載體、柯斯載體、M１3單鏈絲狀噬菌體載體和酵母人工染色體載體各自的組成特點及其在基因工程中的應用.4．簡述質粒的生物學特性有哪些？5.構建人工質粒的目的?６.理想質粒載體應具備的條件及構建需遵循的原則是什么？7．λ-DNＡ作為載體的優點是什么？8。為什么野生型的l噬菌體ＤＮA不宜作為基因工程載體？該如何改造？第四章目的基因的制備1.名詞解釋：目的基因；基因文庫ｃDNA文庫；2.常規分離目的基因的方法有哪些？其原理分別是什么？3.克隆目的基因的方法有哪些？4．什么是基因組文庫（genomiｃlibrarｙ)？構建基因組文庫的原理,涉及哪些基本過程？它同遺傳學上的基因庫、cDNA文庫有什么不同？第五章目的基因的導入和重組子的篩選1.名詞解釋：受體細胞;感受態細胞;轉化；轉導;轉染；體外裝配;轉換子；重組子；轉化率；負篩選；正篩選;ａ-互補篩選２。試述幾種常用的轉化方法。3。試述根據載體的選擇標記進行重組子篩選的方法和原理。試述根據插入序列的表型特征進行重組子篩選的方法和原理。5．DNA片斷之間的連接方式有哪些?各種連接方式的優缺點及DNＡ重組中需要注意什么問題?6.受體細胞選擇的原則？第六章外源基因的表達1．名詞解釋:融合蛋白；分泌蛋白；包涵體；外源基因表達體系2．大腸桿菌表達載體構成的重要元件有哪些？3。試比較大腸桿菌、酵母、植物和動物細胞基因表達載體各自組成的特點.4.真核基因在大腸桿菌中表達存在的問題和高效表達的對策是什么?５.基因表達產物的檢測方法有哪些?第七章基因操作的基本技術1．名詞解釋：分子雜交；探針；PCＲ;引物；隨機引物；切口位移；熱啟動;缺口翻譯;Ｎorthｅｒn印跡;Soｕｔｈern印跡2.DNA制備的基本步驟有哪些？３．堿裂解法和CTAＢ法的原理。４.凝膠電泳有哪幾類?影響瓊脂糖凝膠電泳的參數有哪些？5。PＣR的基本原理是什么？PCＲ反應體系的組成成份是什么?6．試述PCR反應的程序及參數。7．PCR反應引物設計需遵循的原則有哪些？8.試述核酸分子雜交的類型和基本步驟。9.探針標記的方法有哪些？１0．說明Sｏｕtｈｅｒn雜交的原理和方法。11。Nｏrtheｒn印跡與Sｏｕtherｎ印跡有什么不同?第八章植物基因工程及應用1．植物遺傳轉化方法主要有？2.基因槍轉化的優點？3.天然的Ti質粒能作為表達載體使用嗎?為什么？4．理想殺蟲劑應具備什么特性？第九章動物基因工程及應用1。名詞解釋：轉基因生物;共抑制效應；多效性胚胎干細胞2．轉基因共機制效應的特征？３。導致轉基因失活的原因可能有哪些？4.試述動物基因工程的載體有？5．如何篩選轉基因多效性干細胞?第十章醫學基因工程及應用1.名詞解釋:胰島素；基因診斷；基因治療；２?；蜩b定的作用？3。如何進行基因治療？基因工程原理練習題及其答案一、填空題1。基因工程是____＿＿___年代發展起來的遺傳學的一個分支學科.２.基因工程的兩個基本特點是:（1)_____＿__＿＿＿_,（2)__＿______＿_。3．基因克隆中三個基本要點是：_____＿_____；＿_____＿＿_和___＿___＿__。４．通過比較用不同組合的限制性內切核酸酶處理某一特定基因區域所得到的不同大小的片段,可以構建顯示該區域各限制性內切核酸酶切點相互位置的_＿＿__＿_____。5．限制性內切核酸酶是按屬名和種名相結合的原則命名的,第一個大寫字母取自＿＿_____，第二、三兩個字母取自_______＿＿，第四個字母則用____＿＿_____表示。6．部分酶切可采取的措施有：（1)__＿＿__＿＿＿＿_＿(2）____＿__＿___（3）_______＿__＿等.7．第一個分離的限制性內切核酸酶是__＿______＿_；而第一個用于構建重組體的限制性內切核酸酶是＿_＿____＿___＿＿。８．限制性內切核酸酶BsuRI和HａeⅢ的來源不同,但識別的序列都是_＿___＿___,它們屬于___＿_________。9．DNA聚合酶I的Kｌeｎoｗ大片段是用__＿_____＿_＿__切割DＮA聚合酶I得到的分子量為76kDa的大片段,具有兩種酶活性：（1）____＿＿______；(2）_＿______＿____＿__的活性.10．為了防止DNA的自身環化,可用_＿____＿＿___＿_去雙鏈DNA＿___＿__＿＿_＿＿______。1１．EGTＡ是_____＿___＿__離子螯合劑。12．測序酶是修飾了的Ｔ7DＮA聚合酶，它只有_＿____＿______酶的活性，而沒有_______酶的活性。13．切口移位（nｉcktranslation)法標記DNA的基本原理在于利用__＿_＿____的______＿和＿_＿＿__的作用。1４．欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈ＤNＡ分子轉變成平末端的雙鏈形式,通常可采用____＿____或____＿_＿__＿＿_＿__.15．反轉錄酶除了催化ＤNＡ的合成外，還具有＿＿_＿_＿____＿_的作用，可以將ＤＮA—ＲNA雜種雙鏈中的___＿＿______水解掉。1６．基因工程中依據應用對象分有3種主要類型的載體：________＿_＿＿__＿、_＿____＿__＿_＿_、__＿________＿＿_。17.就克隆一個基因（ＤNA片段）來說，最簡單的質粒載體也必需包括三個部分:＿_________＿____、_＿______＿__＿_、_＿_＿__＿__＿_＿__。另外,一個理想的質粒載體必須具有低分子量。18。一個帶有質粒的細菌在有EB的培養液中培養一段時間后，一部分細胞中已測不出質粒，這種現象叫.１9。ｐBR3２2是一種改造型的質粒,它的復制子來源于，它的四環素抗性基因來自于，它的氨芐青霉素抗性基因來自于。2０.ＹAC的最大容載能力是,BAC載體的最大容載能力是。21。ｐSＣl01是一種復制的質粒.22．pUCl8質粒是目前使用較為廣泛的載體。ｐUＣ系列的載體是通過和兩種質粒改造而來。它的復制子來自，Amp抗性基因則是來自。2３．噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：一是；二是。24.野生型的M１3不適合用作基因工程載體，主要原因是和.2５．黏粒(cｏｓｍiｄ)是質?！删w雜合載體，它的復制子來自、COS位點序列來自，最大的克隆片段達到kb。2６。野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是:(1）(2）（3)。2７。噬菌粒是由質粒和噬菌體DＮＡ共同構成的，其中來自質粒的主要結構是，而來自噬菌體的主要結構是。2８.l噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DＮA片段后，總的長度應在噬菌體基因組的的范圍內。29。在分離DNA時要使用金屬離子螯合劑,如EDＴA和檸檬酸鈉等，其目的是.3０.用乙醇沉淀DＮA時，通常要在DNＡ溶液中加人單價的陽離子，如ＮaCl和NaＡc,其目的是.31．引物在基因工程中至少有4個方面的用途：（1）（2）（３）（4）。32．Clａｒk發現用ＴaqDNA聚合酶得到的ＰＣR反應產物不是平末端，而是有一個突出堿基末端的雙鏈DNA分子。根據這一發現設計了克?。蠧Ｒ產物的.33．在cDNＡ的合成中要用到Ｓ1核酸酶,其作用是切除在。34．乙醇沉淀ＤNA的原理是。3５．假定克隆一個編碼某種蛋白質的基因，必須考慮其表達的三個基本條件:(1)_＿＿＿＿____＿_＿＿__＿＿_____＿_______＿＿(２）___＿__＿__＿_____＿＿＿_______＿_＿_(３）__＿___________＿_＿_＿____＿＿________.３6.受體細胞的感受態是__＿_____＿＿__________＿___＿＿_＿_＿_____。3７．DNＡ重組連接的方法大致分為四種：（1)__＿________＿_(2）＿＿___＿＿_＿＿___＿＿(３)＿＿__＿__＿__＿__＿_____＿＿______(4）_________＿_______＿＿___＿____。３8.將含有外源基因組一個酶切片段的質粒稱之為含有一個__＿＿_＿__＿__，各種此類質粒的集合體稱之為構建了一個＿_＿____________＿_。３9．將含有一個mRNA的DＮA拷貝的克隆稱作一個_＿_____＿＿___，源于同一批ＲＮA制備物的克隆群則構建了一個____＿____________。40．只要知道基因組中某一特定區域的部分核苷酸組成,用________＿＿_可以將這段DＮA進行百萬倍的擴增。41．人工感受態的大腸桿菌細胞在溫度為___＿＿＿＿____時吸附DNA，__＿_______＿時攝人DNA。42.目前，在重組體的篩選中，已經發展了許多構思巧妙、具有極高準確性的篩選方法。大致可以分為:（1）________＿____＿_（2)__________＿____（3）____＿＿＿__＿____＿____(4)____＿________________＿__＿___等.43。PCR擴增篩選重組體是比較簡便的篩選方法,它適合于＿____＿_____＿___＿____＿_____＿。４4。核酸雜交探針可分為兩大類:ＤNＡ探針和RNA探針。其中DＮＡ探針又分為___＿＿_____探針和___＿＿_______＿＿_＿__探針。４5.如果用限制性內切核酸酶切割雙鏈ＤNA產生5'突出的黏性末端，則可以用＿___＿___＿＿進行3’末端標記.如果用限制性內切核酸酶切割DNA產生的是3’突出的黏性末端，可以用______＿＿___＿＿＿____進行3'末端標記。46．單鏈DＮA探針的標記可以采用下列方法：（1)_＿_______＿＿＿__＿__＿_＿_＿______＿_＿__＿__（2）＿__＿_＿_____＿__＿___________（３)_______＿_＿＿＿____＿_______＿___＿________。４７。根據Nｏｒｔｈeｒn雜交的結果可以說明：_____＿___＿＿_______＿________________＿_＿____。48.差示雜交(diffeｒenｔialhybｒidizａｔion）技術需要__＿＿＿____＿_______＿_____＿_＿_____＿_。４9.RＮA分子經凝膠電泳后按大小不同分開,然后被轉移到一張硝酸纖維素膜（尼龍膜）上，同一放射ＤNA探針雜交的技術稱__＿___＿___＿___＿__＿__＿_＿。50。在_______＿_＿_____＿技術中,DNA限制性片段經凝膠電泳分離后，被轉移到硝酸纖維素膜（或尼龍膜)上，然后與放射性的DNＡ探針雜交。51。可用T４DＮA聚合酶進行平末端的ＤNＡ標記，因為這種酶具有_________＿＿_和＿_＿＿_＿_的活性。５2。根據外源片段提供的遺傳表型篩選重組體，必需考慮三種因素：(1）_____________＿_（2)＿____＿＿__＿＿_＿__＿____＿___（３）____＿______＿＿_______＿＿.５３．Northerｎ印跡和Ｓouｔｈerｎ印跡有兩點根本的區別：（1）＿＿_______＿_________＿_______________＿_____＿__＿_＿_______＿___＿_＿_____＿____（２）__________＿_＿_＿_＿＿___＿_____________＿＿_＿_______＿_＿＿_＿____＿____＿_____＿＿＿_.５4.放射免疫篩選的原理基于以下三點：(1）_____＿_____＿＿＿_＿______＿_＿__＿______(２）＿_＿__＿____＿_＿_____＿___＿_＿__（3）_＿_＿＿＿＿＿___＿__＿_＿_____＿___＿___＿_＿＿。

答案１。702．(1）分子水平上的操作;(２）細胞水平上的表達3.克隆基因的類型；受體的選擇;載體的選擇4．限制性酶切圖譜５．屬名的第一個字母;種名的前兩個字母；株名6。(1）減少酶量；（2）縮短反應時間;(3）增大反應體積７．EｃoK；EcｏＲl８．GGCＣ;異源同工酶9．枯草桿菌蛋白酶;(1）5'—3’合成酶的活性;（2）３’－5＇外切核酸酶10。堿性磷酸酶；５’端的磷酸基團１１.Cａ2+1２.5＇—3’合成;3’-5’外切１3.DNA聚合酶I:５’一3’外切核酸酶；5'一3’合成酶14．S1核酸酶切割;DNＡ聚合酶補平１5．核酸水解酶H；RNA16．質粒DNA；病毒DNＡ;質粒和病毒ＤＮＡ雜合體1７。復制區：含有復制起點；選擇標記:主要是抗性基因；克隆位點:便于外源DNA的插入１8.質粒消除（或治愈)19，pMBl；pＳCl０1；pSＦ2124(Ｒ質粒)2０.1000kｂ；300kb21。嚴緊22．ｐBＲ322和M１3；pMＢl;轉座子2３．它在細菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNＡ的擴增;對某些噬菌體(如l噬菌）的遺傳結構和功能研究得比較清楚,其大腸桿菌宿主系統的遺傳也研究得比較詳盡24.沒有合適的限制性內切核酸酶識別位點；選擇標記25．質粒;l噬菌體；４5２6.(1）分子量大,(2)酶的多切點，（3)無選擇標記27．復制區；IＧ區28．7５％～105%29．螯合Mｇ2+離子,抑制核酸酶的活性30．中和DNA分子的負電荷，增加DＮＡ分子間的凝聚力31.（1)合成探針;(2)合成cＤNA；(3）用于PCＲ反應；（4)進行序列分析３2.T—載體３3．第二鏈合成時形成的發夾環?３4。乙醇使DNA分子脫水35.（1)保持正確的可讀框（2）能夠使其轉錄的啟動子(3）具有翻譯的起始和終止信號36.接受外源DNA的生理狀態3７。（1）黏性末端連接；（２）平末端連接;（3)同聚物接尾連接；（4）接頭連接法38.基因組DＮA克隆；基因組DＮA文庫３９.cDNA克?。籧DNA文庫40．聚合酶鏈式反應(PCR)４1.0°Ｃ；42°C42．（１)遺傳學方法；(２)物理篩選法；（３)核酸雜交法；(4）表達產物分析法43．插入外源片段的種類較多,大小又極為相似的重組體的篩選４4.基因組DNA；cDNA45．Klenｏw酶填補的方法；T4DNA聚合酶4６．（1）用Ｍ13噬菌體載體合成單鏈ＤNA探針；(2）從mRＮA反轉錄合成單鏈cDＮA探針;（3)用不對稱PCR合成單鏈ＤNA探針4７．外源基因是否進行了轉錄４８.兩種不同的細胞群體能夠表達不同的基因，即在一個群體中能夠表達一些基因，而在另一個細胞群體中不能表達這些基因４９．Ｎoｒthｅrｎ印跡50．Southern印跡51．5’?３’合成酶;3’?５’外切核酸酶52．（１）克隆的是完整的基因；（2)使用的是表達載體；（３）不含內含子53．（1)印跡的對象不同：Norｔhern是ＲNA,Ｓｏuthern是DNA；(2）電泳條件不同,前者是變性條件，后者是非變性條件５４.（１)抗體能夠被吸附到固體支持物上;（2)同一個抗原可以同幾種抗體結合；(３)抗體能夠被標記

二、選擇題(單選或多選）1。因研究重組DNA技術而獲得諾貝爾獎的科學家是（）（a）Ａ。Koｒnｂerg（ｂ)W。Gilｂert（c)P。Berg（d）B.McCｌｉntｏcｋ２。第一個作為重組ＤNA載體的質粒是（）(a）pBR322（ｂ)ColＥl(c）pSCl01(d)pUCl83．關于宿主控制的限制修飾現象的本質，下列描述中只有（）不太恰當。（a）由作用于同一DNＡ序列的兩種酶構成（b）這一系統中的核酸酶都是Ⅱ類限制性內切核酸酶（ｃ)這一系統中的修飾酶主要是通過甲基化作用對DNA進行修飾(ｄ）不同的宿主系統具有不同的限制-修飾系統4.Ⅱ型限制性內切核酸酶：(）（a)有內切核酸酶和甲基化酶活性且經常識別回文序列（ｂ)僅有內切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供（c)限制性識別非甲基化的核苷酸序列(ｄ）有外切核酸酶和甲基化酶活性(e）僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供5．下面有關限制酶的敘述哪些是正確的？（）（a）限制酶是外切酶而不是內切酶（b)限制酶在特異序列（識別位點）對ＤＮA進行切割(c）同一種限制酶切割DNA時留下的末端序列總是相同的（ｄ）一些限制酶在識別位點內稍有不同的點切割雙鏈DNＡ，產生黏末端（e)一些限制酶在識別位點內相同的位置切割雙鏈DNA,產生平末端6.第一個被分離的Ⅱ類酶是：（）(a)EｃｏK（b）HｉndⅢ（c）ＨindⅡ(d）EｃoＢ7．在下列進行DＮＡ部分酶切的條件中，控制那一項最好？(）（a）反應時間（b）酶量（c）反應體積(d)酶反應的溫度8．在下列試劑中,那一種可以螯合Ｃa2＋離子?(）(a）EＤTA(ｂ)檸檬酸鈉(c)SDS（ｄ）EGＴA9．在下列工具酶中，那一種可以被EGTＡ抑制活性?（）(a）S1單鏈核酸酶（b)末端轉移酶(c）堿性磷酸酶(d)Bal31核酸酶１０．限制性內切核酸酶可以特異性地識別：()（a）雙鏈ＤNＡ的特定堿基對(b)雙鏈DＮＡ的特定堿基序列（ｃ）特定的三聯密碼（d)以上都正確１1.下列關于限制性內切核酸酶的表示方法中，正確一項的是(）。(a)Saｕ3AI（b)E。coＲI(c）hindIII(ｄ)Sau3Ａ1１2．限制性內切核酸酶的星號活性是指：()（a)在非常規條件下,識別和切割序列發生變化的活性。(b）活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)識別序列與原來的完全不同13．下面哪一種不是產生星號活性的主要原因？（）(a)甘油含量過高(b）反應體系中含有有機溶劑(c）含有非Mｇ2＋的二價陽離子（d)酶切反應時酶濃度過低14．關于宿主控制的限制修飾現象的本質，下列描述中只有（）不太恰當（ａ)由作用于同一DNＡ序列的兩種酶構成(ｂ)這一系統中的核酸酶都是Ⅱ類限制性內切核酸酶(c）這一系統中的修飾酶主要是通過甲基化作用對ＤNＡ進行修飾（d）不同的宿主系統具有不同的限制-修飾系統15．在長模板鏈的指導下引物延伸合成長的DNA互補鏈時應選用（）（a）T4DＮA聚合酶（b)Klenow酶。（c）大腸桿菌ＤＮA聚合酶I(d)T7DNA聚合酶16．末端轉移酶是合成酶類，（)（a)作用時不需要模板（ｂ）在Ca2＋的存在下，可以在突出的3，末端延長ＤNＡ鏈(c)在Ca2+的存在下，可以在隱蔽的3，末端延長DＮA鏈（ｄ）上述說法有兩種是正確的17．在基因工程中，可用堿性磷酸酶（）(a)防止ＤNＡ的自身環化（b)同多核苷酸激酶一起進行ＤNＡ的5，末端標記（c）制備突出的3，末端（ｄ)上述說法都正確1８．下列酶中，除（)外都具有磷酸酶的活性（a)λ核酸外切酶（ｂ）外切酶Ⅲ（c）單核苷酸激酶(ｄ）堿性磷酸酶19。下列哪一種酶作用時需要引物？()(a）限制酶（b）末端轉移酶(c)反轉錄酶（d）DNA連接酶20．S1核酸酶的功能是（)（a）切割雙鏈的DNＡ（b）切割單鏈的RNA（c）切割發夾環(d）以上有兩項是正確的21。Klｅnoｗ酶與DＮA聚合酶相比,前者喪失了(）的活性.（a）5,——３，合成酶，(b)3，-—5，外切酶(c）5，-－-3,外切酶(d)轉移酶22．下面關于松弛型質粒(relaxedｐlasmiｄ）性質的描述中，()是不正確的(a)質粒的復制只受本身的遺傳結構的控制,而不受染色體復制機制的制約,因而有較多的拷貝數(b）可以在氯霉素作用下進行擴增(c)通常帶有抗藥性標記(ｄ）同嚴緊型質粒融合后，雜合質粒優先使用松弛型質粒的復制子23。基因工程中所用的質粒載體大多是改造過的，真正的天然質粒載體很少,在下列載體中只有（）被視為用作基因工程載體的天然質粒載體(a）pBR３２２(b)pSＣl０1（c)pＵBｌｌ0（d）ｐUCl824。下列哪種克隆載體對外源DNA的容載量最大?（)（a）質粒（b）黏粒（c)酵母人工染色體(YAC）(d）l噬菌體(e）cＤNA表達載體２5。松弛型質粒：（)（ａ）在寄主細胞中拷貝數較多（b）可用氯霉素擴增(c）一般沒有選擇標記（d)上述(a）、(b)兩項正確2６．CｏｌEｌ是惟一用作基因工程載體的自然質粒,這種質粒:（)（a）是松弛復制型（b)具有,四環素抗性(c）能被氯霉素擴增（d)能產生腸桿菌素27。同一種質粒ＤNA，以三種不同的形式存在，電泳時，它們的遷移速率是：（）(a）OCDNA>ＳCＤNA>ＬＤＮA（b)SCDNA〉ＬDNＡ〉OCＤNA(c）LDＮA〉ＯＣＤNA>SCDNA(d)SＣDNA>ＯCDNＡ＞LDＮA28．ｐＢＲ322是一種改造型的質粒,含有兩個抗性基因,其中四環素抗性基因來自：()(a）CoｌEl（b）Rｉ質粒（c)pSCl01(d)pＵＣl82９．關于穿梭質粒載體，下面哪一種說法最正確？(）（ａ）在不同的宿主中具有不同的復制機制(b）在不同的宿主細胞中使用不同的復制起點（c)在不同的宿主細胞中使用不同的復制酶(d)在不同的宿主細胞中具有不同的復制速率30．能夠用來克隆3２ｋb以下大小的外源片段的質粒載體是(）（ａ)charomｉd(ｂ）pｌａsmid（C）cｏsｍid(d)phagｅｍid31。第一個作為重組DNA載體的質粒是()（a)pBR3２2(b)ColEl(c）ｐSＣl０1(d)pUCl8３2．Ti質粒:()（a)可從農桿菌轉到植物細胞中（b)作為雙鏈ＤNA被轉移(c）在植物中導致腫瘤(ｄ)介導冠癭堿的合成，作為細菌的營養物和植物的生長激素（e）需要細菌的ｖiｒ基因幫助轉移（f)在植物細胞中作為染色體外質粒33．黏粒(cosmｉｄ)是一種人工建造的載體，(）（ａ)它具有COS位點，因而可進行體外包裝（ｂ)它具有質粒DNA的復制特性(c）進入受體細胞后,可引起裂解反應（d）進入受體細胞后,可引起溶源化反應34．有兩種確定核酸中核苷酸序列的方法：化學序列分析法(Maxam-Gｌｂerｔ）和酶學序列分析法(Sanｇer）.酶學測序法的基本原理/優點是：（）（a）堿基與特殊染料間不同的相互作用（b）一個合成引物的延伸和ＤＮA修復合成的可靠終止（c）限制性位點與ＤNA末端標記的相關性（ｄ）可同時對DＮA雙螺旋的兩條鏈進行測序（ｅ)反應是DNA特異的,ＲNＡ不會帶來干擾。這樣既減少純化步驟，也節約了開支。35．關于cDNA的最正確的說法是：(）（a)同mRNA互補的單鏈DNA（ｂ）同mRＮA互補的雙鏈ＤNA（c）以mRＮA為模板合成的雙鏈DＮA(d）以上都正確3６．用堿法分離質粒DNＡ時，染色體DNA之所以可以被除去，是因為:（）(ａ）染色體DNA斷成了碎片(b）染色體DNA分子量大,而不能釋放(c）染色體變性后來不及復性（d)染色體未同蛋白質分開而沉淀37.關于堿解法分離質粒ＤＮA，下面哪一種說法不正確？()(a）溶液I的作用是懸浮菌體(ｂ）溶液Ⅱ的作用是使DNA變性(c)溶液Ⅲ的作用是使DNA復性(d）質粒DＮA分子小，所以沒有變性，染色體變性后不能復性3８。Clark做了一個有趣的實驗，發現ＴaｑDNA聚合酶可以不需要模板,在雙鏈DNA的末端加一個堿基,主要是加(）。（ａ)dＧTP(ｂ）dATP（c）ｄCTP（d）dTＴP３９．根據構建方法的不同,基因文庫分為基因組文庫、cDNA文庫等。在下列文庫中,()屬cDNＡ文庫（a）ＹAC文庫（b)MＡC文庫(c）扣減文庫（d）BAC文庫4０.下面關于多克隆位點（multipｌecｌoｎesite，MCS)的描述，不正確的—句是()（a)僅位于質粒載體中（b)具有多種酶的識別序列(c)不同酶的識別序列可以有重疊(d）一般是人工合成后添加到載體中4１．在cDＮA技術中，所形成的發夾環可用（)(a）限制性內切核酸酶切除(b)用31外切核酸酶切除(c)用S1核酸酶切除（ｄ）用51外切核酸酶切除42．在DNＡ的酶切反應系統中，通常：()(a)用SＳＣ緩沖液(b)加入Mｇ２+作輔助因子(c）加入BSA等保護劑(d）上述說法中，有兩項是正確的43。黏性末端連接法，不僅操作方便，而且（）（a)產生新切點（b)易于回收外源片段（c）載體不易環化（d）影響外源基因的表達４4．在下列表型中，()是基因工程上理想的受體菌表型（a）ｒ+m＋rec*(b）r—ｍ-rｅｃ－(C）r—m—reｃ＋(d)ｒ＋ｍ+rec-45．關于DNA接頭在基因工程中的作用,下列說法中哪一項不正確?(）（a）給外源ＤNA添加適當的切點（b）人工構建載體（c）調整外源基因的可讀框（d)增加調控元件４6.cＤNA文庫包括該種生物的（）(a）某些蛋白質的結構基因(b)所有蛋白質的結構基因（ｃ)所有結構基因（d）內含子和調控區47.下列關于建立cＤNＡ文庫的敘述中，哪一項是錯誤的？（)（a）從特定組織或細胞中提?。腘A或ＲNA（b）用反轉錄酶合成ｍRＮA的對應單鏈ＤNA(c）以新合成的單鏈ＤNA為模板合成雙鏈DＮA（d)新合成的雙鏈ＤNA甲基化４８．下列對黏性末端連接法的評價中，哪一項是不正確的？()(a）操作方便(b)易于回收片段(c)易于定向重組（ｄ）載體易于自身環化，降低重組率４９．關于感受態細胞性質的描述,下面哪一種說法不正確?（）（功具有可誘導性(b)具有可轉移性(c)細菌生長的任何時期都可以出現（d）不同細菌出現感受態的比例是不同的5０．下面關于用T4多核苷酸激酶標記5＇端制備探針的描述中(）是不正確的。（a)既能標記DＮＡ,又能標記ＲＮA（b）既能標記雙鏈DNA又能標記單鏈DNA（c)只能標記突出的5＇端不能標記其他類型末端(d)DNA或RNA必須有5'—OH的存在５1．Sｏｕｔheｍ印跡的DＮＡ探針（）雜交.（a)只與完全相同的片段（b）可與任何含有相同序列的DＮＡ片段(c）可與任何含有互補序列的DNA片段’.（d)可與用某些限制性內切核酸酶切成的DNA片段(e)以上都是5２．用下列方法進行重組體的篩選,只有()說明外源基因進行了表達.(a)Soutｈem印跡雜交（ｂ）Ｎortｈem印跡雜交（c)Weｓtern印跡（ｄ)原位菌落雜交53．下列哪一個不是Souｔheｒn印跡法的步驟？()（ａ）用限制酶消化ＤNA(a)DＮA與載體的連接（c)用凝膠電泳分離ＤNＡ片段（ｄ)ＤNA片段轉移至硝酸纖維素膜上(ｅ）用一個標記的探針與膜雜交54。報告基因（）(a)以其易于分析的編碼序列代替感興趣基因的編碼序列（b）以其易于分析的啟動子區代替感興趣基因的啟動子區(c）能用于檢測啟動子的活性（d）能用于確定啟動子何時何處有活性55．在利用ｌacZ失活的顯色反應篩選法中,IＰTＧ的作用是（）（a）誘導宿主的α肽的合成（b)誘導宿主的ω肽的合成（c）作為酶的作用底物(d)作為顯色反應的指示劑56.切口移位是指在()作用下，使（)帶上放射性標記。（ａ）DNA聚合酶I,RNA(b）DNA聚合酶I,DNＡ(c)DＮA聚合酶Ⅲ，ＲNA（d）ＤNA聚合酶Ⅲ,DＮA57．用于核酸分子雜交的探針可以是放射性標記的（）（a）DNA(ｂ）RNＡ（c)抗體(d）抗原58．Sｏｕtｈｅrｎ印跡是用DNA探針檢測DNA片段，而Northern印跡則是:（）（a)用ＲＮA探針檢測DNA片段（b）用ＲNA探針檢測RNA片段(ｃ）用DＮＡ探針檢測RNA片段（d)用DNA探針檢測蛋白質片段59.用免疫化學法篩選重組體的原理是()（a)根據外源基因的表達(ｂ)根據載體基因的表達（c)根據mRＮＡ同DNＡ的雜交(d）根據DNA同DNA的雜交6０。隨機引物標記探針,下列各項中哪一項是不正確的?()(a）雙鏈ＤNA、單鏈DNＡ、RＮA都是可以標記的（b)不需要用DnａsｅＩ預處理(c)反應時可用Klｅnow酶（d)反應時可用DNA聚合酶161.在切口移位標記DNA探針時只能使用（）（a）Kｌｅnow酶（b)DNA聚合酶I(c）DＮA聚合酶Ⅱ(ｄ）ＤNA聚合酶Ⅲ6２.要對一雙鏈的DNA分子進行31末端標記,可用（)（a)Klｅnow酶（b）DNA聚合酶I（ｃ）T４DNＡ聚合酶（d)T7DNA聚合酶

答案１.c；2.c；３．b;４．ｂ５．b,C，d，e；6．ｃ；7．b;8。d;9．ｄ；10．B；１1。d;１2。a；13。d；14.ｂ１5．d;1６.c；１7．ａ,b；１８。a;19.c;２０.d;21。c;２２。C;23．ｂ；24.C；25．d；2６．a，C,d；27．b；28.c;2９。b；３０．a；３1．c;32。a，c，ｄ,ｅ,３3．a,b,c；34.b；3５。c；36．ｃ；37．d；38.b;39.c；40。a；41。ｃ;42.ａ，ｂ，c；43。b；44．ｂ；４５．d；46。a；47.a；48.c；４９．c；50。b；51．c;５２。ｃ;53.b；５4.ａ，ｃ,d；５５．a；56．b；５７。a,b；58．ｃ；59。ａ；60。d;61.b；62.c;

三、簡答題1.說明ＳaｎｇerDＮA測序法的原理。2。某學生在用ＥcoRＩ切割外源DＮＡ片段時，出現了星號活性,請分析可能的原因?3.在序列5'—ＣGＡACATＡTGＧAＧT-3'中含有一個6bp的Ⅱ類限制性內切核酸酶的識別序列,該位點的序列可能是什么？４．下面幾種序列中你認為哪一個(哪些)最有可能是Ⅱ類酶的識別序列:GAAＴCG，AＡATTT，GATAＴC，AＣＧGCA？為什么？５．當兩種限制性內切核酸酶的作用條件不同時,若要進行雙酶切,應采取什么措施？為什么？6.為什么反轉錄酶在聚合反應中會出錯?7．什么是測序酶（sｅqｕｅnａseTM）？8。什么是S1核酸酶作圖（Ｓ1nｕcｌeaｓemａppiｎg）？９ＹAC載體具有什么樣的功能性DNA序列?為什么在克隆大片段時，ＹＡC具有優越性?１0。列舉質粒載體必須具備的4個基本特性。11．什么叫穿梭載體？1２.如何將野生型的ｌ噬菌體改造成為一個理想的載體？1３．ＰＣＲ的基本原理是什么?用PCＲ擴增某一基因,必須預先得到什么樣的信息？14。cDNA克隆與基因組克隆有何不同？1５.怎樣將一個平末端DＮA片段插入到EｃｏＲI限制位點中去?1６.簡述以黏粒為載體構建基因文庫的原理。17。酵母人工染色體要在酵母細胞中穩定存在，必須有哪些基本的結構?18。何謂YAC？主要特性是什么？1９。Mｕllｅr的ＰCＲ反應同大腸桿菌體內的DNA復制有哪些不同?你認為根本的差別在哪里？20。欲將一真核生物的結構基因克隆后轉移到原核生物（如Ｅ.coli)中進行表達，克隆時應注意哪些問題？21。假定你分離到一個E。ｃolｉ的Thｙ—突變體,并推測有可能是ThyA基因突變。請設計一個方案用PCR從染色體DNA擴增突變的ThyA基因,測定突變的序列。（注：E.coｌi野生型的ThyA基因的序列是已知的）22．你在做Ｓouthern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據方案,下面一步驟是用NaOH溶液浸泡凝膠，使ＤNA變性為單鏈.為了節省時間，你略過了這一步，直接將DNＡ從凝膠轉至硝酸纖維素膜上。然后用標記探針雜交,最后發現放射自顯影片是空白。錯在哪里？2３.切口移位（niｃktranｓlａtｉon)標記探針的主要步驟有哪些?24.用EcｏRＩ和HｉｎdⅢ分別切割同一來源的染色體DＮＡ，并進行克隆,在前者的克隆中篩選到Ａ基因，但在后者的克隆中未篩選到A基因，請說明原因。25。什么是Wｅsｔerｎ印跡?它與Southｅｒｎ印跡有什么不同?26。用一限制性內切核酸酶切割Lac＋Teｔ＋的質粒載體，已知該酶識別的是4個堿基序列，并產生有兩個堿基突出的單鏈末端，該酶在lac基因內有切割位點，并在第二個氨基酸密碼子內，該位點可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用DＮA聚合酶將單鏈末端補齊為雙鏈的平末端,然后重新連接成環,轉化Lac-Teｔs受體菌,篩選Tｅｔr轉化子，問：Lac的基因型是什么？并說明原因。2７．在基因工程中,為了在細菌細胞中表達真核生物的基因產物,為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在ｃDNA前加上細菌的啟動子?

答案1．答:SangerＤＮA測序法是建立在兩個基本原理之上:(1)核酸是依賴于模板在聚合酶的作用下由５’端向３'端聚合（DＮA聚合酶參與了細菌修復DNＡ合成過程）；(2)可延伸的引物必須能提供游離的3'羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的３’羥基末端，因此會終止聚合反應的進行.如果分別用4種雙脫氧核苷酸終止反應，則會獲得４組長度不同的DNA片段.通過比較所有ＤNA片段的長度可以得知核苷酸的序列。2．答：鹽離子濃度不對，溫度不對,甘油濃度過高。3.答：回文序列是:5'—CATAＴG-３,4．答：GATAＴＣ;AAATTT,因為它們是回文序列.5.答：注意星活性,先低鹽,后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活,再加第二種酶，否則，易產生星活性?；蚴褂猛ㄓ镁彌_液。6．答：由于反轉錄酶缺少在E．cｏliＤNA聚合酶中起校正作用的3’-5’外切核酸酶活性,所以聚合反應往往會出錯,在高濃度的ｄＮＴP和Mg2＋下，每５00個堿基中可能有一個錯配。７.答:所謂測序酶即是修飾了的Ｔ7ＤNA聚合酶,是采用缺失的方法,從外切核酸酶結構域中除去28個氨基酸,這樣使T7DＮA聚合酶完全失去了3'－5’的外切核酸酶活性,只有５'－-—3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～９倍，測序時常用此酶。８.答:Ｓ1核酸酶作圖是一種對RＮA轉錄產物的末端和剪接位點進行作圖的方法.9.答:YAC帶有天然染色體所有的功能元件,包括一個著絲粒,一個DＮA復制起點，兩個端粒。YAＣ能夠容納長達幾百kｂ的外源DNＡ,這是質粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數目。1０．答：（1）獨立復制；（２）有選擇標記;（3)有獨特的酶切位點;（4）能轉化但不擴散.11．答：含有細菌質粒和克隆的真核生物DNＡ片段的雜種質粒,有兩個復制起點和既能在細菌又能在真核細胞中進行選擇的選擇標記，所以,很容易從一宿主轉到另一個宿主(來回穿梭）。12．答：（1）削減分子量（除去非必需區和整合區）；(2)削減酶切位點；(3）添加選擇標記；(４）引入終止突變1３．答：（1）DＮA半保留復制的原理，在體外進行ＤNA的變性、復性和引物延伸。(２)至少要預先知道足夠合成一對引物的靶ＤNA序列。１4。答：基因組克隆包含所有不在cDＮＡ中出現的內含子。1５．答：化學合成一些長為10bp含有EcｏRＩ識別位點的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來,如果用EcｏＲＩ切割這種連接片段,就會產生ＥcoＲI的單鏈末端.這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內切酶位點中。16。答：（1）CＯＳ位點可以自身環化；(2）可以利用ＣOS位點包裝l噬菌體顆粒；(3）可以感染寄主細胞；（4）利用質粒復制子復制，不整合、不裂解。17．答:（1)著絲粒;（２）端粒；(3)ＡRS序列。1８。答:（1）含有來自其他生物DNＡ的酵母人工染色體，叫ＹAC；(2）主要特性是可以克隆較大的外源片段。19.答：PCR用雙引物，體內復制用單引物。20。答：應注意的問題有：啟動子、密碼子、剪接、分泌。21。答：為了擴增突變體的thyA基因,先設計一對引物,其中一個引物的序列與thｙＡ基因的5’端相同,另一個引物同該基因的3'端互補。在引物的5’端加上合適Ⅱ類限制性內切核酸酶的識別序列，以便于后來的克隆。將染色體DNA同引物混合后，進行PCR擴增。然后進行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴增片段，可以直接測序或克隆到合適的載體再測序.22．答：如果你的雜交探針是雙鏈的，可能因為在加人雜交混合物之前忘記將探針變性而得到空白的放射自顯影結果。23．答:(１）DNaｓｅＩ造成切口；（2)DＮA聚合酶IIＩ的5’?３’外切核酸酶進行切割；(３）DＮＡ聚合酶Ⅲ的5’?3’合成酶進行修補；（4）在修補過程中,隨著切口（ｎick）的移動，將放射性的底物摻人到雙鏈ＤＮＡ中。２4.答：原因是：ＨindⅢ的切點在A基因內。2５.答：Ｗestern印跡是將蛋白質經電泳分離后從凝膠中轉移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進行檢測。它與Southern的不同在于探針的性質不同，在Wｅｓtern印跡中使用的探針是抗體(蛋白質）.26。答：基因型是lac-．原因是在該密碼子中插入了兩個堿基，造成了移碼突變,所以Lａc的基因是缺陷的。27．答:這是因為細菌沒有內含子剪接系統,并且不能識別真核生物的啟動子之故.

四、問答題：1．說明限制性內切核酸酶的命名原則要點。2．什么是限制性內切核酸酶的星號活性？受哪些因素影向？3.影響DNA連接酶催化連接反應的因素有哪些？４。什么是Ｋlenｏｗ酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5.細菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途?６.λ外切核酸酶(1amｂｄａｅxｏｎuｃlease）基本活性是什么？在基因工程中有什么應用?7.Mn２+、Mg２+對DnaseI(deoxyribonucleaｓe？)的活性有什么影響？ＤnａseI在基因工程中有什么作用?８。質粒如何維持在細胞中的穩定?9．由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全，進行嚴格的監控，質粒載體的安全性是十分重要的.請問質粒載體的安全條件包括哪幾個方面？１０。為什么野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體？１1．什么是藍白斑篩選法?12.藍白斑篩選法為什么也會有假陽性？13．M１3系列載體具有哪些優缺點？1４．黏粒載體具有哪些特點與不足?15。輔助噬菌體DＮA和相應的噬菌粒是如何協同工作的？16．如果知道某一基因的功能及其相應的蛋白質的氨基酸序列組成，可以通過何種方法克隆該基因？１７．什么是基因文庫？1８．什么是基因組文庫(ｇｅnｏmｉｃlibｒarｙ）？構建基因組文庫，涉及哪些基本過程？它同遺傳學上的基因庫有什么不同？1９．什么是ｃＤNA文庫(compｌemｅnｔＤNAlibｒarｙ)?同基因組文庫有何差別?20．黏性末端連接法是最常用的連接方法,具有許多優點,但是也有一些不足，請指出這些不足之處。21．什么是同聚物加尾連接法(hｏmｏｐｏｌｙｍeｒtailsｊoｉning）？用何種方法加尾?具有哪些優缺點？2２。何謂接頭連接法(１ｉnkeｒligaｔiｏn）?２3。什么是同裂酶？為什么說用同裂酶進行體外重組效率最高？24。為了大量獲得許多用于生化鑒定的產物,你想將擬南芥中的一個序列已知、編碼單體酶蛋白的基因在單細胞微生物中表達，你如何確保最終能得到產物?25。某一質粒載體具有Ｔｅｔr和Kａnr的表型,在Kan抗性基因內有一BglI的切點?，F用BglI切割該載體進行基因克隆，問:(1)轉化后涂皿時應加什么樣的抗生素?（2）培養后長出的菌落具有什么樣的抗性基因型？（3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體？２6．以pBR32２DNA作為載體，從四環素抗性基因區克隆外源DＮA時,可采用環絲氨酸富集法篩選重組體,說明其基本原理和基本操作過程.27．放射性抗體檢測法(rａdioaｃｔｉvｅａnｔｉｂodyｔest)的基本原理是什么?28．什么是隨機引物（randompｒimer）?如何標記DNA？２9.什么是印跡（bｌotｔing)雜交?30.什么是原位菌落雜交（colonyｈybridization）？3１。說明Southern雜交的原理和方法.32．Noｒthern印跡與Southｅrn印跡有什么不同?33.建立了一個基因文庫后,如何鑒定一個攜帶目的基因的克?。看鸢福?.答：限制性內切核酸酶采用三字母的命名原則,即屬名＋種名+株名的各一個首字母，再加上序號?；驹瓌t：3-4個字母組成，方式是:屬名＋種名＋株名＋序號；首字母:取屬名的第一個字母，且斜體大寫；第二字母:取種名的第一個字母，斜體小寫;第三字母:（1)取種名的第二個字母，斜體小寫;（2）若種名有詞頭，且已命名過限制酶，則取詞頭后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名則作為第四字母，是否大小寫,根據原來的情況而定,但用正體。順序號：若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正體。２。答：Ⅱ類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性,但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環境條件下表現出來的特異性.條件的改變，限制酶的特異性就會松動，識別的序列和切割都有一些改變,改變后的活性通常稱第二活性，而將這種因條件的改變會出現第二活性的酶的右上角加一個星號表示，因此第二活性又稱為星活性。概括起來，誘發星活性的因素有如下幾種:(１）高甘油含量(〉5％，v／v）;(2)限制性內切核酸酶用量過高（〉10０U/ugＤNA）；（3）低離子強度（<2５mmol/L）；（4）高pＨ（８．0以上);（5)含有有機溶劑，如DMＳO，乙醇等；（6）有非Mg２＋的二價陽離子存在(如Mｎ2+,Cu2+，Ｃ0２+，Zｎ2+等)。3．答：影響DNＡ連接酶催化連接反應的因素有很多，但溫度對連接反應的影響較大。黏性末端鏈通常以1２°C一15°C最好,這種溫度有利于末端退火和連接酶的活性穩定。溫度高了難以進行末端退火，低于上述溫度會降低連接酶的活性.平末端連接以室溫為宜，因為平末端連接不存在DＮA的退火問題,但是溫度高于30℃，連接酶特別不夠穩定。平末端連接時連接酶的濃度要比黏性末端連接時高１0－1０0倍。ＤNA中有殘存的tRＮA不會抑制ＤNＡ連接酶的活性，但是，如果NaCｌ的濃度高于１5０mmｏl/Ｌ，則對連接反應有強的抑制作用。另外反應體系中有NＨ４+離子的存在，對Ｅ。coｌiDNA連接酶具有激活作用.Ｅ。coliＤNA連接酶需要NAD+作輔助因子,而T４ＤNA連接酶需要ATP。4．答：Kｌenoｗ酶是1９74年Kｌenｏｗ用枯草桿菌蛋白酶水解DＮA聚合酶I，得到兩個片段,其中大片段的分子量為75kDａ，它具有5'—3＇聚合酶和3'-5’外切核酸酶的活性，小片段具有５'-３’外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNＡ聚合酶Ｉ中會降解５＇引物的５'－3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用.Kｌenoｗ酶主要有下列用途：（１）修復反應，制備平末端可用Klｅｎow酶修復限制性內切核酸酶或其他方法產生的5＇或3'突出末端,制備平末端,這樣可以使原來具有不相容的黏性末端的DNＡ片段通過平末端重組。如在反應系統中加入放射性同位素標記的脫氧核苷酸，用這種末端填補的方法可以制備３’末端標記的探針。用Kｌenow酶修復5’突出末端的反應主要是利用了Klｅｎoｗ酶的DNA聚合酶活性,是填補反應；而修復３’突出末端則是用Ｋlenow酶的3＇—5’外切核酸酶的活性，是切割反應.用Klｅnow酶的切割反應來修復3＇突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。（2）標記DＮA３＇突出末端（ｐrotrｕdinｇend）該反應分兩步進行：先用３＇-5'的外切核酸酶活性除去3＇突出末端，產生3'隱含末端，然后在高濃度的標記底物(-32ｐ—dＮTP）存在下,使降解(3’—5＇）作用與聚合(5’—3＇）作用達到平衡.這種反應也叫交換或取代反應（exｃhaｎge／rｅｐlａｃemeｎtrｅaction)。不過這一反應用T4DＮA聚合酶的效果更好，因它的3'-5’外切核酸酶活性較強.（3)其他的一些用途:包括用雙脫氧末端終止法進行ＤＮA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(ｐriｍerｅxｔension)制備單鏈DNA探針等。5．答：主要差別是：CIP68°C時失活,而BＡP６8°Ｃ穩定，且耐酚抽提。應用:(1）ｄｓDNA的5'端脫磷酸，防止ＤＮA的自身連接。但是用CIP處理后，最好將CIP除去后，再進行連接反應.(2)DNＡ和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進行末端標記。6.答：外切核酸酶是從噬菌體感染的E．ｃoli中分離純化的，能夠從雙鏈DNA上依次切下5’單核苷酸，作用底物是雙鏈ＤNＡ的５'磷酸末端,不能切割羥基化5’端.該酶雖然能切割單鏈ＤNA,但效率較低(下降200倍）。不能切割帶切口或缺口的dsDNA。該酶作用時是行進性的，一步一步進行的.在基因工程中主要用于除去雙鏈DNA突出的5’末端,以便讓末端轉移酶加尾。7．DＮaｓeI是一種內切核酸酶，在Mg2+存在下,DＮａsｅＩ隨機切割DNA兩條鏈中的任意一條鏈；當Ｍn2＋代替Mｇ2+時,DNａseI幾乎是在雙鏈ＤNＡ兩條鏈相對的位置上打開缺口，使雙鏈ＤNA斷裂,產生的末端幾乎是平末端或只突出1～2個核苷酸的ＤＮA片段。ＤNａseI有許多用途:(1）在切口移位標記中，制造切口;(2）在足跡法中保護DＮA;(3）除去RＮＡ制備物中的DNA；（4)體外轉錄中除去DNA模板;（5）檢測染色體中的轉錄活性區；(6）產生可在噬菌體Ｍ13載體上進行測序的隨機克隆。8.質粒通過以下幾種機制維持在細胞中的穩定：(1）多聚體質粒的分解如果質粒在復制時形成多聚體的話,在細胞分裂過程中質粒丟失的可能性就會增加。一個多聚體是由多個單體相互連接而成的。多聚體的形成可能是由于在復制終止時發生錯誤或者是由于單體間重組的結果。由于多聚體在細胞分裂時將作為一個質粒進入一個子細胞，這樣，多聚體的形成就大大降低了質粒的有效拷貝數，因此，多聚體也就大大增加了細胞分裂時質粒丟失的機會.為了避免這種情況的發生，很多質粒都具有位點專一性重組的系統，可以破壞多聚體。（2）分離（parｔitｉoniｎｇ)質粒通過一種分離系統來防止在細胞分裂過程中質粒的丟失,這種機制保證在細胞分裂過程中每個子細胞至少可得到一個質粒拷貝，這是由稱為par功能（Parfunｃｔioｎs）完成的.所謂pａr功能是指某些質粒，包括F、Ｒ1等質粒上具有的一些短的區域，這些區域能夠增強質?？截惖暮线m分配。如果從質粒中將這種區域拿掉，質粒丟失的頻率就會相當高。已經深入研究過Ｐ1質粒的分離系統,發現Ｐ1質粒的分離系統由一個順式激活pａr序列和兩個蛋白ParA和,PａrB的基因構成,其中一個蛋白同ｐar位點結合.關于par位點是怎樣增強質粒適當分離的機制有兩種模型，按照這兩種模型，細菌的膜具有真核生物有絲分裂紡錘體的功能,在細胞分裂之前將質粒分開。par位點是質粒同質膜結合的區域，在細胞分裂時,由于膜的生長,質粒的兩個拷貝就被拉到兩個子細胞中。這兩個模型對于細胞分裂時，質粒同質膜的結合是怎樣保證每個細胞至少得到一個質粒的解釋是不同的。模型.A:ｐar位點同細菌質膜的一個假定位點結合。在這個模型中，每一種質粒都有它自己獨特的同質膜結合的位點。當細胞生長時，位點也加倍,每一個質粒拷貝結合一個位點.由于這些位點隨著細胞分裂而分開,每一個質?？截悓⒎峙涞揭粋€子細胞。這就保證了質粒不會丟失.該模型要解決的問題是質膜上必須有許多獨特的位點以供不同的質?？截惤Y合,這似乎不太可能。將模型Ａ稍微改動一下，就可以滿足質粒分離所需的位點。如果我們假定質粒結合的位點不在質膜而是在細菌的染色體上就可以了。染色體上有很多的位點,并且隨著DNA的復制而加倍，這些位點可供質粒結合。剩下的唯一問題就是在質膜上有同染色體結合的獨特位點,這樣，質粒將隨著染色體的分離而分離。模型B同模型A基本類似，在這個模型中，質粒的兩個拷貝在同質膜結合之前必須通過它們的ｐar位點相互配對。然后這兩個質粒在細胞分裂過程中隨著質膜位點的分離而分離。高拷貝數的質粒常常具有增加質粒適當分離的位點，但是這些區域并沒有相同的結構，并不以相同的機制起作用。例如，質粒ｐSCl01的par區可以增加質粒的超螺旋，至于超螺旋的增加如何幫助質粒的適當分離是不清楚的?？赡苁窃鰪娏速|粒分離后的迅速復制，防止了下次分裂時的丟失。（３）質粒溺愛（plasmidａｄｄictiｏｎ）即使質粒具有分離功能,質粒也會從增殖的細胞中丟失。在一類復仇的細胞中，質粒能夠編碼一些殺死丟失了質粒的細胞。像F質粒、R1質粒、以及P1噬菌體都有這種功能。這些質粒編碼一些毒性蛋白質，這些蛋白質一旦表達就會殺死細胞。根據質粒的來源不同，毒性蛋白質可通過各種方式殺死細胞。例如，質粒的毒性蛋白Ccd，通過改變DNA螺旋酶來殺死細胞,由于螺旋酶的改編，引起了雙螺旋DNA的斷裂。質粒R1的殺手蛋白Ｈok,破壞細菌細胞質膜的功能，引起細胞活力的喪失。為什么毒性蛋白僅僅是在細胞丟失了質粒之后立即殺死細胞？當細胞含有這種質粒時,沉溺系統的蛋白質或ＲNA可作為一種解毒藥,既能阻止毒蛋白的合成,又能同毒蛋白結合并阻止毒蛋白起作用。然而,這些其他基因的產物要比毒性蛋白不穩定得多,所以它們會很快失活。如果一個細胞丟失了質粒，既沒有毒性蛋白也沒有解毒劑的合成。但是,由于解毒劑更不穩定,當解毒劑失活后,毒性蛋白就可以起殺傷作用。這些系統使細胞對質粒產生溺愛，并防止細胞丟失質粒。9。（１）非傳遞性和不被帶動轉移。對于多數基因克隆操作來說，都不希望載體能夠進行自主傳遞，也不希望被帶動轉移。（２)具有條件致死突變，如溫度敏感質粒pＪC30７（CoｌEl的衍生質粒）在哺乳動物正常體溫下就喪失復制能力,可防止克隆基因擴散，只存在于限定的宿主細胞中.（3）一般情況下不希望與宿主染色體發生重組,因為重組后有可能給宿主帶來突變。（４）有較小的宿主范圍。10．（１）菌體DNA沒有容載能力,因為噬菌體的頭部對DNA包裝的量是有限制的,不能大于基因組的10５%，所以要將l噬菌體改造成載體，必須削減分子量.（２)野生型的lDNＡ對于一些常用的酶都有多個識別和切割位點，不便于克隆。（３）沒有可供選擇的標記。（4)野生型的ｌ噬菌體具有感染性,因此不夠安全.11．這種方法是根據組織化學的原理來篩選重組體。主要是在l載體的非必要區插入一個帶有大腸桿菌ｂ—半乳糖苷酶的基因片段,攜帶有lac基因片段的l載體轉入ｌac的宿主菌后，在含有5—溴-４—氯—3—引哚-ｂ—D—半乳糖苷（X－gal)平板上形成淺藍色的噬菌斑。外源基因插人lａc(或lａc基因部分被取代)后,重組的噬菌體將喪失分解X－gaｌ的能力，轉入laｃ－宿主菌后，在含有5—溴-4—氯—3—引哚—b—Ｄ—半乳糖苷（Ｘ-gａl）平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍色噬菌斑。12.b—半乳糖苷酶的Ｎ末端是非必需的,，可以進行修飾,并不影響酶的活性或a肽的互補性。如果插入的外源DＮA引起a肽的可讀框的改變，或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就會形成白色噬菌斑.如果插入DＮA的堿基數正好是３的倍數，或者插入的DNA中不含有終止密碼的話，仍然會形成藍色噬菌斑。這種插入物的長度可達幾百個堿基對。M13載體的這種性質可以用來檢測和選擇產生新的終止密碼或改變可讀框，即移碼突變。１3。M13克隆系統具有很多優點：(1）克隆的片段大:M13噬菌體的DNＡ在包裝時不受體積的限制,所以容載能力大，有報道,有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體ＤNＡ長６—7倍的ＤNA(插人片段可達40kb）。(2)可直接產生單鏈DNＡ，這對于DNＡ測序、DNＡ誘變、制備特異的單鏈DNＡ探針都是十分有用的。（3）單鏈ＤNA和雙鏈ＤNA都可以轉染宿主，并可根據人工加上的選擇標記進行篩選。M13克隆系列的不足：(1）較大的外源片段插入后,在擴增過程中往往不夠穩定，一般說,克隆的片段越大，發生丟失的機率越大.（2）單鏈載體分子感染的細胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。1４.主要特點有：（１）具有質粒復制子，進入寄主細胞后能夠像質粒一樣進行復制,并且能夠被氯霉素擴增。（2)具有質粒載體的抗生素抗性基因的選擇標記。（3)具有l噬菌體的包裝和轉導特性。(4)容載能力大?？寺〉淖畲笃卧?５ｋb，最小片段為１9kb。(5)簡化了篩選.如果載體的分子量在5kb的話，得到的轉導子幾乎排除由載體自連的可能性，因為要被成功包裝，至少要７個分子的載體自連,盡管如此，也是不能被包裝的，因為COS位點太多了。黏粒載體也有如下不足：（1）如果兩個黏粒之間有同源序列，可能會發生重組，結果會使被克隆的片段重排或丟失.(2)含不同重組DNA片段的菌落生長速度不同，會造成同一個子板上菌落大小不一.另外由于不同大小的插入片段對宿主細胞的作用不同,會造成文庫擴增量的比例失調.(3)包裝過程復雜，包裝效率不穩定,代價高。１5.雖然噬菌粒載體攜帶有M13的IG區，能夠合成單鏈DNA，但是