江蘇省寄生蟲病防治研究所顧亞萍瘧原蟲鏡檢技術(shù)瘧原蟲的基本形態(tài)特征血片制作與染色瘧原蟲計數(shù)顯微鏡的維護與保養(yǎng)

瘧疾是由蚊子傳播的寄生蟲病，它的病原體是瘧原蟲。寄生于人體的瘧原蟲有4種1.核

呈鮮紅色，呈圓形或橢圓形。核的結(jié)構(gòu)致密，只有在個別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)2.細胞漿

藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長大，細胞漿逐漸增多。瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)胞漿瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團塊。間日瘧原蟲－－呈短棒狀，黃褐色；惡性瘧原蟲－－呈細砂狀，黑褐色；三日瘧原蟲－－呈砂粒狀，深褐色；卵形瘧原蟲－－與間日瘧原蟲相似。3.瘧色素滋養(yǎng)體期：早期、晚期滋養(yǎng)體裂殖體期：未成熟、成熟裂殖體配子體期：雌、雄配子體瘧原蟲在RBC內(nèi)各期形態(tài)各不相同瘧原蟲在紅細胞內(nèi)按照生長發(fā)育繁殖的階段不同瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)紅細胞通常漲大薛氏點明顯環(huán)狀體較粗大滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足血片中可見各期的原蟲形態(tài)成熟裂殖體約含12-24個裂殖子，排列不規(guī)則

間日瘧（P.vivax）

鑒定要點卵形瘧（P.ovale）

診斷要點紅細胞略漲大或正常，卵圓形或邊緣呈鋸齒狀環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚薛氏點出現(xiàn)較早粗大，量多成熟裂殖體約含6-12個裂殖子

5.常可查見各階段的瘧原蟲

惡性瘧原蟲厚血膜RingsGametocytes間日瘧原蟲

厚血膜環(huán)狀體配子體滋養(yǎng)體裂殖體

由于在血膜制備過程中紅細胞溶解，因而其原形態(tài)消失，且染液和玻片上可能存在雜質(zhì)等，要根據(jù)瘧原蟲的三個基本要素仔細加以鑒別。（1)疑似瘧色素（2）疑似瘧原蟲核（3）疑似瘧原蟲胞漿瘧原蟲與其他異物的鑒別（4）血液成份與分析（5）雜質(zhì)---類似瘧原蟲的物質(zhì)（6）形態(tài)失常

瘧原蟲成份丟失。成份增加。形態(tài)改變。藥物影響。血片的制作與染色

每張載玻片上分別做1個薄血膜，1個厚血膜。標準血膜的位置如下圖所示。血片制作取血液4-5μl

血滴置于載片的中央偏右1/3，由里向外劃圈涂成直徑為0.8-1厘米厚薄均勻、圓形厚血膜.血片制作厚血膜的涂制：薄血膜的涂制：取血液1-1.5μl血滴置于載玻片的中央，將推片的一端置于血滴之前，當血液在載玻片與推片之間向兩側(cè)擴展至約2cm寬時，兩玻片保持20-30°角，推成舌狀薄血膜，長約2-2.5CM。血片制作血片染色兩種染色方法:吉氏染色法瑞氏染色法常用吉氏染色法

吉氏染液：染色方法薄血膜經(jīng)甲醇固定干燥后，用PH7.0-7.2的磷酸緩沖液或蒸餾水將吉氏原液稀釋，原液與緩沖液為1:20。混勻染色20-30分鐘，晾干鏡檢。厚血膜溶血染色

放置多時未染色的血片（2天以上，薄片已用甲醇固定），在染色之前，須在厚血膜上用清水進行溶血，待血膜全部溶解后倒掉，用吉氏染液染色,清水漂洗干凈,晾干。染色用水和沖洗用水pH7.0～pH7.2緩沖蒸餾水效果最佳。先制備好兩種貯備液貯備液I1/15M磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液

Na2HPO49.5g

蒸餾水1000ml貯備液Ⅱ1/15M磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶液

KH2PO49.07g

蒸餾水1000ml血片制作注意事項（1）在制作血片前，首先要核對患者的姓名、年齡和住址（2）載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細胞均勻分布不重疊和空泡，血膜末端呈舌狀。（3）厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見5-10個白細胞為宜。（4）制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果．血片制作注意事項（1）染料溶劑的質(zhì)量（2）染液的新舊（3）染液稀釋后使用時間原液必須臨用時稀釋，隨配隨用。（4）染液的稀釋濃度（5）染色時間

(6)染色稀釋用水:Ph7.0-7.2

染色質(zhì)量影響因素（7）血膜在制備后應盡量能在當天染色，一般夏天不超過48小時，冬天也不能超過72小時。新制血片染色時厚血膜無需溶血放置多時的血片，在染色之前先用清水滴加在厚血膜上進行溶血.瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算

計算瘧原蟲密度的三種方法：●白細胞原蟲密度計數(shù)法(厚血膜WHO)●半定量計數(shù)法(厚血膜)●紅細胞感染密度計算法(薄血膜)白細胞原蟲密度計數(shù)法鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個白細胞中的瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低，可增加白細胞，計數(shù)500-1000個。密度單位:原蟲數(shù)/μl計算公式：瘧原蟲數(shù)÷計數(shù)的白細胞數(shù)×患者每微升血白細胞數(shù)=瘧原蟲數(shù)/μl血。如果不知患者的白細胞數(shù)，則每微升血以8000個白細胞計數(shù)(國際標準)。瘧原蟲密度計算厚血膜的瘧原蟲計數(shù)從血膜的左上角開始，橫向。計數(shù)1個視野后，每次間隔5個視野,再計數(shù)。厚血膜瘧原蟲密度計算顯微鏡的使用與維護1.學習鏡檢瘧原蟲之前，必須熟悉顯微鏡的基本構(gòu)造，使用方法和維修與保養(yǎng)。防止油鏡進灰、進油和發(fā)霉。2.瘧原蟲的厚薄血片都必須在油鏡下觀察，顯微鏡用光要充足。包括反光鏡、光圈、聚光器要達到油鏡使用的最佳限度。顯微鏡檢查注意事項3.玻片未加油時觀察標本應按：低倍→高倍→油鏡程序。如在加油區(qū)內(nèi)重找目標應按照：低倍→油鏡程序，不要經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。注意保護鏡頭，切不可壓碎標本被片，損壞鏡頭。顯微鏡檢查注意事項4.視野模糊不清

顯微鏡問題：鏡頭鏡油用量、沾污灰塵或含有氣泡；油鏡頭破損、進油或有霉斑、灰塵；顯微鏡用光調(diào)整不足。血片問題：載玻片不潔、毛玻璃樣或有霉斑；血片染色過度或血膜過厚。顯微鏡檢查注意事項顯微鏡檢查注意事項5.應先學會看薄血膜，掌握薄血膜上各期的形態(tài)特征后，再學看厚血膜。對熟練的鏡檢員一般以鏡