HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!第四章目的基因的獲取目的基因：準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!

基因克隆的本質(zhì)是把某一目的DNA片段通過(guò)無(wú)性方式進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，而這一過(guò)程往往是通過(guò)載體和寄主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目標(biāo)DNA片段的獲得；2、克隆載體的構(gòu)建；3、寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；4、重組體克隆的選擇和鑒定。

目前，以大腸桿菌為寄主，以質(zhì)粒和噬菌體等為載體的基因克隆體系已經(jīng)相當(dāng)?shù)某墒臁XY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!節(jié)

基因組DNA片斷化一、限制性?xún)?nèi)切酶法用限制性?xún)?nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!二、隨機(jī)片斷化1.限制性?xún)?nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開(kāi)。①內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度。（1）限制性?xún)?nèi)切酶的選用原則HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!2.機(jī)械切割法（1）超聲波超聲波強(qiáng)烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片斷。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!①

保護(hù)dNTP的5’端P或3’端-OH③

用酸或堿脫保護(hù)（1）原理1.磷酸二酯法②

帶保護(hù)的單核苷酸連接保證合成反應(yīng)的定向進(jìn)行。帶5’保護(hù)的單核苷酸與帶3’保護(hù)的另一個(gè)單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來(lái)。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!

將個(gè)核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。

固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。15合成的二核苷酸連接處有三個(gè)酯鍵！HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!化學(xué)合成的DNA片斷一般在200bp以?xún)?nèi)。二、

化學(xué)合成DNA片斷的組裝用T4多核苷酸激酶使各個(gè)片段的5’端帶上磷酸。1.互補(bǔ)連接法預(yù)先設(shè)計(jì)合成的片斷之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不同片斷之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)的完整雙鏈。（2）5’端磷酸化（1）互補(bǔ)配對(duì)（合成的DNA單鏈的5’端是-OH）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!2.互補(bǔ)延伸連接法預(yù)先設(shè)計(jì)的片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可以相互作為另一個(gè)片斷延長(zhǎng)的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3’

5’

5’

3’

5’

3’

T4DNA連接酶Klenow片段引物HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!DNA合成儀5.合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點(diǎn)人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptorHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!（2）目前常用的載體

2.構(gòu)建基因文庫(kù)的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對(duì)載體的要求載體系列：

容量為

24kpcosmid載體：

容量為

50kbYAC：

容量為

1MbBAC:容量為

300kbHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!（2）載體與基因組DNA大片段的連接①

粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adaptor）人工合成的限制性?xún)?nèi)切酶粘性末端片斷。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!例如：人的基因組是

3×109bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建。4.構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA鏈3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH堿HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。方法二：妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來(lái)合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!三、文庫(kù)的查詢(xún)（screening）用目的基因探針與文庫(kù)中的重組載體進(jìn)行Southernblot雜交。文庫(kù)載體探針電泳后雜交放射自顯影測(cè)序分析HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁(yè)!纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過(guò)柱與探針堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCRHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁(yè)!從表達(dá)A蛋白和不表達(dá)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。將表達(dá)A蛋白的mRNA合成cDNA鏈。再同不表達(dá)A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達(dá)的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁(yè)!3.mRNA差異顯示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端的錨定引物Oligo(dT)引物的3’端加兩個(gè)核苷酸（倒數(shù)第二個(gè)不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁(yè)!（3）5’端的隨即引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

擴(kuò)增cDNA鏈。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNNNN5’

3’

cDNA第二鏈，并PCRHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁(yè)!（5）隨機(jī)-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測(cè)序膠中電泳。選擇有差異的帶，進(jìn)一步PCR作探針。篩選文庫(kù)，找到差別基因的全長(zhǎng)序列。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁(yè)!原核基因組部分原核細(xì)胞提取基因組DNAPCR擴(kuò)增HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁(yè)!目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA鏈目的基因的引物2目的

基因cDNA第二鏈PCRmRNAHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁(yè)!大腸桿菌作為寄主進(jìn)行DNA克隆的實(shí)驗(yàn)方案DNA片段的獲得載體構(gòu)建細(xì)菌轉(zhuǎn)化重組體的鑒定限制性?xún)?nèi)切酶消化機(jī)械切割雙鏈cDNA的合成化學(xué)法直接合成同聚物加尾粘性末端連接平末端連接加接頭造成粘性末端重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體外包裝進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)表型鑒定核酸雜交免疫學(xué)分析酶切鑒定HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁(yè)!由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。1.優(yōu)點(diǎn)2.缺點(diǎn)目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgeneHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁(yè)!1）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個(gè)切點(diǎn)。2）6bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個(gè)切點(diǎn)。隨機(jī)程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連。（Sau3A—BamHI）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁(yè)!1976年H.G.Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。第二節(jié)

化學(xué)合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動(dòng)化合成法。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁(yè)!原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應(yīng)的單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。2.磷酸三酯法HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁(yè)!固相磷酸三酯合成過(guò)程固相支持物結(jié)果是全保護(hù)的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對(duì)氯苯。最后脫保護(hù)固相支持物固相支持物CHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁(yè)!T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁(yè)!1.直接合成基因三、

寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA

3.合成探針序列4.定點(diǎn)突變合成合成帶有定點(diǎn)突變的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁(yè)!

將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。

理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。一、基因文庫(kù)的構(gòu)建1.基因文庫(kù)（genelibrary）第三節(jié)

目的基因的保存和擴(kuò)增HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁(yè)!斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度合適于載體連接。不能用一般的限制性?xún)?nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備3.基因文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。

①

物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化。可得到10-30kb的隨機(jī)片斷。②

酶切法：HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁(yè)!各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買(mǎi)。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁(yè)!4.基因組文庫(kù)的大小一個(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁(yè)!1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱(chēng)cDNA。2.cDNAlibrary二、

cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱(chēng)cDNA文庫(kù)。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁(yè)!分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化Column（柱）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁(yè)!反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成①cDNA鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的鏈。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁(yè)!方法一：剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來(lái)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA鏈cDNA第二鏈5’

3’

③cDNA第二鏈合成HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁(yè)!mRNAcDNA3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA鏈3’

5’

引物mRNAcDNA鏈3’

5’

mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA鏈3’

5’

RNaseHDNAligase去引物HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁(yè)!④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA鏈cDNA第二鏈5’

3’

cDNA鏈cDNA第二鏈5’

3’

5’

3’

HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁(yè)!在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁(yè)!6.cDNA文庫(kù)的大小一個(gè)cDNA文庫(kù)要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫(kù)包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1nHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁(yè)!第四節(jié)

目的基因的分離和擴(kuò)增一、目的基因的分離1.探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來(lái)分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁(yè)!2.mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁(yè)!AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥磷灰石柱過(guò)柱吸收RNA-DNA單鏈濾過(guò)羥磷灰石柱BAPCR16cDNA文庫(kù)HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁(yè)，您