β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定法12/10/20221β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定法12/10/20221第一節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)一、定義β-內(nèi)酰胺類抗生素（β-lactamantibiotics）系指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括臨床最常用的青霉素（penicillins）與頭孢菌素（cephalosporin），以及近年開發(fā)的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等其他非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素。

系對(duì)藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。其分子量一般在1000～5000，個(gè)別可至約10000道爾頓，小于化工、生化領(lǐng)域中所指的高分子化合物的分子量。

12/10/20222第一節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)一、定β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)二、分類及來(lái)源按其來(lái)源分為兩類：外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì)。外源性雜質(zhì)：包括蛋白、多肽、多糖等類雜質(zhì)或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的結(jié)合物。一般來(lái)源于發(fā)酵工藝，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。12/10/20223β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)二、分類及來(lái)源12/10/2內(nèi)源性雜質(zhì)：抗菌藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程，又可在儲(chǔ)存中形成，甚至在用藥時(shí)使用不當(dāng)也可產(chǎn)生。抗生素聚合物的免疫原性通常較弱，但作為多價(jià)半抗原，可引發(fā)速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。

免疫原性(immunogenicity)：抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。抗原性(antigenicity)：抗原與其誘生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞有特異性結(jié)合的能力。也寫作反應(yīng)原性。

完全抗原：同時(shí)具備2個(gè)性質(zhì)。天然的蛋白質(zhì)都是完全抗原。半抗原(hapten)：只有抗原性而沒有免疫原性的物質(zhì)，即只能與抗體結(jié)合，卻不能單獨(dú)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)，稱為半抗原。一般分子量較小，如化學(xué)藥物。半抗原+載體(carrier)→完全抗原

。

速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)是一種常見的過(guò)敏反應(yīng)，主要為呼吸道過(guò)敏反應(yīng)、消化道過(guò)敏反應(yīng)、皮膚過(guò)敏反應(yīng)以及過(guò)敏性休克。隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高，目前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，對(duì)內(nèi)源性聚合物的控制是當(dāng)前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的重點(diǎn)。12/10/20224內(nèi)源性雜質(zhì)：抗菌藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程，又圖1水溫引起阿莫西林干糖漿中高分子雜質(zhì)含量的變化12/10/20225圖1水溫引起阿莫西林干糖漿中高分子雜質(zhì)含量的變化12/β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)三、形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)特征（一）青霉類抗生素：高分子雜質(zhì)有蛋白（多肽）類雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)兩大類。12/10/20226β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)三、形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)特征12/青霉噻唑多肽：制劑中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在3500～2400道爾頓左右，有青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)和多肽的伯氨基按親核反應(yīng)機(jī)理縮合而成，主要發(fā)生在發(fā)酵工藝中。樣品在儲(chǔ)存過(guò)程中，多肽類雜質(zhì)殘留的自由氨基仍與β-內(nèi)酰胺反應(yīng)，直至被飽和，反應(yīng)速度和樣品本身的水分含量及儲(chǔ)存溫度有關(guān)。12/10/20227青霉噻唑多肽：12/10/20227青霉噻唑蛋白的基本結(jié)構(gòu)青霉素G內(nèi)酰胺環(huán)斷裂點(diǎn)12/10/20228青霉噻唑蛋白的基本結(jié)構(gòu)青霉素G內(nèi)酰胺環(huán)斷裂點(diǎn)12/10/20青霉素聚合物：1.反應(yīng)僅和母核結(jié)構(gòu)有關(guān)，側(cè)鏈中的活性基團(tuán)不參與反應(yīng)。一分子青霉素首先開環(huán)，形成一新的活性位點(diǎn)，并與另一分子青霉素聚合。2.側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng)主要以氨芐青霉素為代表，反應(yīng)時(shí)側(cè)鏈上的氨基親核攻擊β-內(nèi)酰胺抗生素的羰基碳原子，形成聚合物。12/10/20229青霉素聚合物：12/10/20229頭孢菌素：頭孢菌素中的高分子雜質(zhì)主要是不同類型的聚合物。1.只與母核結(jié)構(gòu)有關(guān)的N型聚合反應(yīng)eg.頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮等2.側(cè)鏈參與的L型聚合反應(yīng)。eg.頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻肟等在堿性條件下，兩種反應(yīng)都可以發(fā)生。12/10/202210頭孢菌素：頭孢菌素中的高分子雜質(zhì)主要是不同類型的聚合物。12β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)四、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)高度的不均一性和不確定性。1.青霉噻唑多肽（蛋白）類雜質(zhì)發(fā)酵中產(chǎn)生的任何蛋白及蛋白碎片都可能帶入到產(chǎn)品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可以結(jié)合不同數(shù)目的藥物分子。12/10/202211β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)四、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)12/10/202.聚合物類雜質(zhì)：青霉素、頭孢菌素不僅能形成聚合度不同的聚合物，許多樣品還能同時(shí)發(fā)生不同機(jī)理的聚合反應(yīng)。3.形成的聚合物可發(fā)生不同程度的分（降）解反應(yīng)，如開環(huán)等。4.對(duì)以異構(gòu)體形式存在的樣品，同聚和異聚反應(yīng)可同時(shí)發(fā)生。5.實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)高分子雜質(zhì)的種類及數(shù)量和生產(chǎn)工藝密切相關(guān)，如氨芐西林鈉，溶媒法和噴霧干燥法的高分子雜質(zhì)具有不同的特異性，且二者的聚合物含量明顯不同。凍干粉二聚物溶媒粉二聚物12/10/2022122.聚合物類雜質(zhì)：青霉素、頭孢菌素不僅能形成聚合度不同的聚合β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)五、影響聚合物形成的因素1.青霉素的聚合物青霉素的聚合反應(yīng)速度在溶液條件下和溶液的酸堿度關(guān)系密切；在固體條件下主要和樣品的水分含量有關(guān)。

12/10/202213β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)五、影響聚合物形成的因素122.頭孢菌素的聚合物固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度的關(guān)系密切。貯存溫度較低時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量盡管有影響，但影響不大；但當(dāng)貯存溫度上升至37℃時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量的影響十分顯著。12/10/2022142.頭孢菌素的聚合物12/10/202214β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)六、口服青霉素類藥物使用前進(jìn)行皮試的必要性口服青霉素類抗生素在國(guó)內(nèi)外均有過(guò)敏反應(yīng)報(bào)道，但其原因未有試驗(yàn)報(bào)道。有相關(guān)報(bào)道，在青霉素V聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。因此，在口服青霉素類抗生素前，必須進(jìn)行皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，這是十分必要的。12/10/202215β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)六、口服青霉素類藥物使用前進(jìn)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)七、抗生素高分子雜質(zhì)的質(zhì)控意義1.β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)是引發(fā)臨床速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原；2.高分子雜質(zhì)經(jīng)注射和口服都可引起過(guò)敏反應(yīng)，因此注射劑和口服劑都應(yīng)控制。3.高分子雜質(zhì)是β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，可評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量和穩(wěn)定性，并可借此進(jìn)一步評(píng)價(jià)其生產(chǎn)工藝。12/10/202216β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)七、抗生素高分子雜質(zhì)的質(zhì)控意第二節(jié)高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)質(zhì)控方法化學(xué)分析免疫學(xué)分析色譜法分光法（P值法）間接血凝法豚鼠PCA法反相模式離子交換模式凝膠色譜模式一、概述12/10/202217第二節(jié)高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)質(zhì)控方法化學(xué)分析免由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生物學(xué)特性，如：均為過(guò)敏性雜質(zhì)，因此，在藥物質(zhì)量控制中一般不需分別控制不同結(jié)構(gòu)的高分子雜質(zhì)含量，而只需控制藥品中高分子雜質(zhì)的總量。故根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離的凝膠色譜模式是簡(jiǎn)便易行的分離模式。以葡聚糖凝膠SephadexG-10為基礎(chǔ)的凝膠色譜分析方法，可簡(jiǎn)便地用于對(duì)各種β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的分離、分析，并滿足藥品質(zhì)量控制的需要。12/10/202218由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生物學(xué)特性，如：均為過(guò)敏高分子雜質(zhì)分析方法二、凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)

12/10/202219高分子雜質(zhì)分析方法二、凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)12/10凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)1.凝膠色譜法凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。它是利用某些凝膠對(duì)混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進(jìn)行分離、分析的方法。

12/10/202220凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)1.凝膠色譜法12/10/202凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)2.凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理（1）利用凝膠色譜的分子篩機(jī)制，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。讓藥物分子自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而所有的高分子雜質(zhì)被排阻，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)讓所有高分子雜質(zhì)具有相同的保留時(shí)間的設(shè)想。12/10/202221凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)2.凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理凝膠滲透色譜按分子大小分離原理圖12/10/202222凝膠滲透色譜按分子大小分離原理圖12/10/202222凝膠過(guò)濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對(duì)某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數(shù)Kav（被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。

12/10/202223凝膠過(guò)濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且實(shí)驗(yàn)證明，SephadexG-10凝膠可基本保證所有的β-內(nèi)酰胺抗生素中的高分子雜質(zhì)被排阻。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav:分配系數(shù)；Ve：被分離物質(zhì)洗脫體積；Vo：柱內(nèi)凝膠床中顆粒間自由空間所占有的體積（外水體積）；Vt：柱內(nèi)凝膠顆粒占有的體積與外水體積之和（柱床體積）

一般Kav≈0洗脫的組分視作高分子雜質(zhì)。12/10/202224實(shí)驗(yàn)證明，SephadexG-10凝膠可基本保證所有的外水體積（Vo）

：凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，即液體流動(dòng)相體積；內(nèi)水體積（Vi）

：凝膠顆粒中孔穴的體積，即固定相體積；基質(zhì)體積（Vg）

：凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。Vt=Vo+Vi+Vg柱床體積（Vt）：凝膠柱所能容納的總體積12/10/202225外水體積（Vo）：凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，即液體流洗脫體積（Ve）：將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積。一般是介于Vo和Vt之間的。（1）對(duì)于完全排阻的大分子，由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動(dòng)相中，故Ve=

Vo；（2）對(duì)于完全滲透的小分子，由于可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)，故Ve=

Vt；分子量介于兩者之間的分子，其洗脫體積也介于兩者之間，但，有時(shí)也出現(xiàn)Ve＞

Vt，這是由于這種分子與凝膠的吸附作用造成的。12/10/202226洗脫體積（Ve）：將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積凝膠層析洗脫示意圖（1）完全排阻的大分子（2）中等分子（3）完全滲透的小分子（4）吸附分子12/10/202227凝膠層析洗脫示意圖（1）完全排阻的大分子（2）中等通常選用藍(lán)色葡聚糖2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。該物質(zhì)分子量大（為200萬(wàn)），呈藍(lán)色，它在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測(cè)（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。但是，在測(cè)定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，不宜用藍(lán)色葡聚糖2000測(cè)定外水體積，因?yàn)樗鼘?duì)激酶有吸附作用，所以有時(shí)用巨球蛋白代替。12/10/202228通常選用藍(lán)色葡聚糖2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。該物質(zhì)分子Vo的測(cè)定12/10/202229Vo的測(cè)定12/10/202229Vt的測(cè)定12/10/202230Vt的測(cè)定12/10/202230（2）由于溶質(zhì)分子和凝膠介質(zhì)間存在多種次級(jí)相互作用，溶質(zhì)分子可被吸附于凝膠介質(zhì)的表面。（3）在凝膠顆粒內(nèi)部具有較大的比表面積和較小的自由空間，故溶質(zhì)分子更易和凝膠介質(zhì)接觸，因此溶質(zhì)分子在凝膠顆粒內(nèi)部較凝膠顆粒外部更易被吸附。（4）即，色譜過(guò)程中除分子排阻作用外，凝膠對(duì)藥物分子的吸附作用大于對(duì)高分子雜質(zhì)的吸附作用。12/10/202231（2）由于溶質(zhì)分子和凝膠介質(zhì)間存在多種次級(jí)相互作用，溶質(zhì)分子有目的的利用藥物分子和凝膠間的次級(jí)相互作用，使藥物分子吸附于凝膠顆粒內(nèi)表面，進(jìn)而改善高分子雜質(zhì)和藥物分子之間的分離度。（5）在深入研究藥物和葡聚糖凝膠的相互作用及流動(dòng)相對(duì)該相互作用的影響的基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)節(jié)色譜過(guò)程中的流動(dòng)相組成、濃度、pH和流速等參數(shù)，調(diào)節(jié)藥物分子和凝膠顆粒間的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)高分子雜質(zhì)和藥物分子間的分離度。12/10/202232有目的的利用藥物分子和凝膠間的次級(jí)相互作用，使藥物分子凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)3.

SephadexG-10凝膠色譜法分離β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)的概況：在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中，理論上β-內(nèi)酰胺抗生素三聚體以上的高分子雜質(zhì)均集中在Kav=0的色譜峰中；調(diào)節(jié)各種色譜條件，既可使β-內(nèi)酰胺抗生素的寡聚物（如青霉素類抗生素的二聚物等）和其它高分子雜質(zhì)分離，又可使其二者合二為一，因此可用于不同的分析目的。12/10/202233凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)3.SephadexG-10高分子雜質(zhì)分析方法三、色譜條件對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中色譜行為的影響12/10/202234高分子雜質(zhì)分析方法三、色譜條件對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素在Seph色譜條件的影響1.流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)溶質(zhì)保留行為的影響：流動(dòng)相的離子強(qiáng)度和色譜行為雖然并無(wú)直接聯(lián)系，但一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)流動(dòng)相中的離子種類不改變時(shí)，離子強(qiáng)度越大，β-內(nèi)酰胺類抗生素的Kav值越大。

12/10/202235色譜條件的影響1.流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)溶質(zhì)保留行為的影響：12/在被測(cè)物濃度較高時(shí)，流動(dòng)相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰形和分離效果。有研究表明，在流動(dòng)相中添加中性鹽如氯化鈉或增加緩沖液的濃度后，均使離子強(qiáng)度增加，使β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)得到有效分離。12/10/202236在被測(cè)物濃度較高時(shí)，流動(dòng)相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰色譜條件的影響2.流動(dòng)相種類對(duì)溶質(zhì)色譜行為的影響：常用流動(dòng)相有：檸檬酸緩沖液、硫酸銨緩沖液、磷酸緩沖液、醋酸緩沖液等。改變流動(dòng)相中緩沖液的種類，可以改變?nèi)苜|(zhì)的色譜行為，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素，表現(xiàn)為其Kav值的改變及色譜峰型的變化。

12/10/202237色譜條件的影響2.流動(dòng)相種類對(duì)溶質(zhì)色譜行為的影響：12/10流動(dòng)相0.1mol/L頭孢菌素的Kav值頭孢他啶頭孢曲松頭孢噻吩檸檬酸緩沖液0.452.522.06硫酸銨0.361.761.45磷酸緩沖液0.311.361.42醋酸緩沖液0.270.791.00碳酸鹽緩沖液0.210.550.88硝酸鈉0.150.210.58流動(dòng)相中緩沖液種類對(duì)頭孢菌素色譜行為的影響12/10/202238流動(dòng)相頭孢菌素的Kav值頭孢他啶頭孢曲松頭孢噻吩檸檬酸緩沖液測(cè)定次數(shù)緩沖鹽0.1mol/L理論板數(shù)拖尾因子1磷酸緩沖液31911.43檸檬酸緩沖液23852.542磷酸緩沖液41211.43檸檬酸緩沖液31202.40流動(dòng)相對(duì)頭孢他啶高分子雜質(zhì)色譜行為的影響12/10/202239測(cè)定次數(shù)緩沖鹽理論板數(shù)拖尾因子1磷酸緩沖液31911.43檸分析證明，影響這種變化的決定因素是緩沖液中的陰離子種類，陰離子所帶的負(fù)電荷越多，溶質(zhì)的Kav值相對(duì)越大，色譜峰也越易拖尾。12/10/202240分析證明，影響這種變化的決定因素是緩沖液中的陰離子種類，陰離色譜條件的影響3.流動(dòng)相pH的影響

對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。當(dāng)流動(dòng)相中有多元酸/鹽存在時(shí)，pH通過(guò)影響多元酸的解離，改變緩沖液中的陰離子類型，來(lái)改變?nèi)苜|(zhì)的保留時(shí)間。12/10/202241色譜條件的影響3.流動(dòng)相pH的影響12/10/202241色譜條件的影響4.洗脫速度的影響流速越大，溶質(zhì)的保留值減小。反之，溶質(zhì)的保留值增大。這是由于流速較快時(shí)，溶質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的概率減小，導(dǎo)致與葡聚糖凝膠相互作用的機(jī)會(huì)減少之故。12/10/202242色譜條件的影響4.洗脫速度的影響12/10/202242色譜條件的影響5.溶質(zhì)保留值和半峰寬的關(guān)系β-內(nèi)酰胺抗生素在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中的半峰寬與其保留時(shí)間均呈線性關(guān)系。也就是說(shuō)，保留時(shí)間越大，半峰寬越大，峰型越難看。12/10/202243色譜條件的影響5.溶質(zhì)保留值和半峰寬的關(guān)系12/10/202第三節(jié)分子排阻色譜法中國(guó)藥典2005版二部規(guī)定，分子排阻色譜法是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)，其分離原理即為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的測(cè)定采用分子排阻色譜法。12/10/202244第三節(jié)分子排阻色譜法中國(guó)藥典2005版二部規(guī)定，分子排阻自身對(duì)照外標(biāo)法原理——

在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中，由于SephadexG-10的排阻分子量?jī)H為700道爾頓，因此，除部分寡聚物外，β-內(nèi)酰胺抗生素中的高分子雜質(zhì)在色譜過(guò)程中均不保留；即所有高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，其kav=0。

12/10/202245自身對(duì)照外標(biāo)法原理——12/10/202245自身對(duì)照外標(biāo)法在特定條件下，β-內(nèi)酰胺抗生素由于分子間的氫鍵、靜電、疏水相互作用等次級(jí)相互作用，可以形成締合物，導(dǎo)致其表觀分子量增大。此時(shí)，在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中和高分子雜質(zhì)具有相似的色譜行為，即在kav=0處表現(xiàn)為單一的色譜峰。12/10/202246自身對(duì)照外標(biāo)法在特定條件下，β-內(nèi)酰胺抗生素由于分子間的氫鍵自身對(duì)照外標(biāo)法測(cè)定方法——利用以上所述原理，在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中，以藥物自身為對(duì)照品，測(cè)定其在特定條件下締合時(shí)的峰響應(yīng)指標(biāo)；再改變色譜條件，測(cè)定樣品高分子雜質(zhì)和藥物分離后，kav=0處高分子雜質(zhì)的峰響應(yīng)指標(biāo)；按外標(biāo)法計(jì)算，既得藥品中高分子雜質(zhì)相當(dāng)于藥品本身的相對(duì)含量。流動(dòng)相B：水流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液12/10/202247自身對(duì)照外標(biāo)法測(cè)定方法——流動(dòng)相B：水12/10/20224為什么采用自身對(duì)照外標(biāo)法？定量分析法的理論基礎(chǔ)：通過(guò)檢測(cè)器的物質(zhì)的量與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)成正比，其檢測(cè)器響應(yīng)可以是面積或峰高。含量響應(yīng)值(A或H)定量方法：外標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法峰面積歸一法主成分對(duì)照法12/10/202248為什么采用自身對(duì)照外標(biāo)法？含量響應(yīng)值定量方法：12/10/2

1.外標(biāo)法以待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照品為參照物，根據(jù)供試品的量和對(duì)照品的量以及對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行定量的方法。

高聚物對(duì)照品較難制備，即使制備的高聚物對(duì)照品由于不穩(wěn)定也較難保存，而且不同批制備的對(duì)照品很難同質(zhì)。β-內(nèi)酰胺抗生素高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性。12/10/2022491.外標(biāo)法12/10/2022492.歸一化法將測(cè)得色譜圖上，所有色譜峰面積求和，與每個(gè)色譜峰面積相比較，即得每個(gè)色譜峰的百分比，把所有的色譜峰的百分比相加即得100%，稱為峰面積歸一化。

對(duì)于高分子雜質(zhì)來(lái)說(shuō)，其含量和藥物本身含量相差甚遠(yuǎn)，測(cè)量誤差較大。12/10/2022502.歸一化法12/10/202250高分子雜質(zhì)樣品主峰12/10/202251高分子雜質(zhì)樣品主峰12/10/2022513.內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法是結(jié)合了峰面積歸一法和外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)的一種方法，它在加入內(nèi)標(biāo)后，按峰面積歸一法的分析方法進(jìn)行分析，這就避免了由于進(jìn)樣的一致性及樣品歧視效應(yīng)導(dǎo)致的偶然誤差，因而，它的分析精密度也是比較高的，是氣相色譜的一種比較理想的定量分析方法。

12/10/2022523.內(nèi)標(biāo)法12/10/2022524.主成分對(duì)照法由于SephadexG-10凝膠色譜分離系統(tǒng)的柱效較低，進(jìn)樣微量的藥物很難表現(xiàn)出色譜峰。12/10/2022534.主成分對(duì)照法12/10/202253基本分析方法12/10/202254基本分析方法12/10/202254儀器1.恒流泵1）轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速范圍：0.1-120rpm,正反轉(zhuǎn)可逆

2）調(diào)速方式：無(wú)級(jí)調(diào)速配以線性數(shù)碼旋鈕連續(xù)可調(diào)

3）速度分辯率：30rpm以下為0.1rpm，30rpm以上為1rpm硅膠管

1）粗細(xì)合適2）壁厚1.5mm3）耐磨12/10/202255儀器1.恒流泵硅膠管12/10/202255儀器2.玻璃層析柱合理選擇層析柱的長(zhǎng)度和直徑，是保證分離效果的重要環(huán)節(jié)，理想的層析柱的直徑與長(zhǎng)度之比一般為1：25～1：100.12/10/202256儀器2.玻璃層析柱12/10/202256儀器3.檢測(cè)器β-內(nèi)酰胺抗生素通常都有較明顯的紫外吸收特征，所以測(cè)定中一般選擇紫外檢測(cè)器，通常用到的檢測(cè)波長(zhǎng)是254nm。12/10/202257儀器3.檢測(cè)器12/10/202257儀器3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

積分儀選擇性記錄,進(jìn)行積分處理和定量計(jì)算色譜工作站色譜控制\數(shù)據(jù)采集\記錄\計(jì)算\分析\圖譜保存\實(shí)驗(yàn)結(jié)果編排\打印于一體12/10/202258儀器3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)積分儀色譜工作站12/10/20225系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.以藍(lán)色葡聚糖2000的保留時(shí)間來(lái)表示高分子雜質(zhì)的保留特征，考察對(duì)照品色譜峰及高分子雜質(zhì)色譜峰與藍(lán)色葡聚糖2000溶液色譜峰保留時(shí)間的比值均應(yīng)不超過(guò)某一限度。

中國(guó)藥典要求是0.93～1.07。對(duì)照品峰和供試品溶液聚合物峰與相應(yīng)色譜中藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時(shí)間的比值也是0.93～1.07。12/10/202259系統(tǒng)適用性試驗(yàn)12/10/202259流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相B：水5.3495.18612/10/202260流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相B：水5.3495.18612/2.理論板數(shù)在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中，按藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算，理論板數(shù)均不小于700。12/10/2022612.理論板數(shù)12/10/2022613.拖尾因子在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中，按藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算，拖尾因子均小于2.0。12/10/2022623.拖尾因子12/10/2022624.重復(fù)性RSD考察對(duì)照品在流動(dòng)相B系統(tǒng)中重復(fù)進(jìn)樣后峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)符合規(guī)定。12/10/2022634.重復(fù)性RSD12/10/202263流動(dòng)相B：水測(cè)定對(duì)照品，在Kav=0處表現(xiàn)為單一的色譜峰，以藥物自身為對(duì)照品，測(cè)定這一條件下締合時(shí)的峰響應(yīng)指標(biāo)。5.305測(cè)定過(guò)程12/10/202264流動(dòng)相B：水5.305測(cè)定過(guò)程12/10/202264流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液測(cè)定供試品，測(cè)定樣品中高分子雜質(zhì)和藥物分離后，Kav=0處高分子雜質(zhì)的峰響應(yīng)指標(biāo)。5.34512/10/202265流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液5.34512/10/202265影響準(zhǔn)確測(cè)定的若干因素1.峰響應(yīng)值的選擇2.檢測(cè)器類型及其線性范圍3.進(jìn)樣量的影響4.對(duì)照品異質(zhì)性的影響12/10/202266影響準(zhǔn)確測(cè)定的若干因素1.峰響應(yīng)值的選擇12/10/2022分離度定義：分離度是指高分子聚合物與藥物單體之間分離程度（或分離能力）。Hp——次高峰到基線的高。Hv——次高峰與最大峰曲線分離的最低點(diǎn)到基線的高。

12/10/202267分離度定義：分離度是指高分子聚合物與藥物單體之間分離程度（或分離度影響因素1.凝膠對(duì)藥物吸附作用的強(qiáng)弱與結(jié)構(gòu)有關(guān)2.與洗脫劑組成有關(guān)3.與流動(dòng)相的離子強(qiáng)度有關(guān)4.與流動(dòng)相的pH有關(guān)5.與流動(dòng)相的流速有關(guān)12/10/202268分離度影響因素1.凝膠對(duì)藥物吸附作用的強(qiáng)弱與結(jié)構(gòu)有關(guān)12/1第四節(jié)SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)1.凝膠的預(yù)處理凝膠：溶膠或溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)空隙中充滿了作為分散介質(zhì)的液體（在干凝膠中也可以是氣體），這樣一種特殊的分散體系稱作凝膠。沒有流動(dòng)性。內(nèi)部常含有大量液體。葡聚糖凝膠屬于彈性凝膠彈性凝膠失去分散介質(zhì)后，體積顯著縮小，而當(dāng)重新吸收分散介質(zhì)時(shí)，體積又重新膨脹。

12/10/202269第四節(jié)SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技凝膠粒度的選擇：一般來(lái)說(shuō)，細(xì)顆粒分離效果好，但流速慢；而粗顆粒流速快，但會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，使洗脫峰變平而寬。因此，如用細(xì)顆粒凝膠宜用大直徑的層析柱，用粗顆粒時(shí)用小直徑的層析柱。在實(shí)際操作中，要根據(jù)工作需要，選擇適當(dāng)?shù)念w粒大小并調(diào)整流速。

12/10/202270凝膠粒度的選擇：12/10/202270凝膠溶脹方法：稱取葡聚糖凝膠，緩慢地傾倒入5～10倍的去離子水中或蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時(shí)，或沸水浴溶脹

2小時(shí)，一般采用后一種方法（能除去凝膠中污染的細(xì)菌，同時(shí)排除氣泡）。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，最后減壓抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，準(zhǔn)備裝柱。

商品凝膠是干燥的顆粒，使用時(shí)需經(jīng)溶脹處理，根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量為20，1克SephadexG─20吸水后形成的凝膠體積約40ml。

12/10/202271凝膠溶脹方法：商品凝膠是干燥的顆粒，使用時(shí)需經(jīng)溶脹處理，根據(jù)凝膠再生：

對(duì)于不銹鋼色譜柱其方法是:先用水反復(fù)進(jìn)行逆向沖洗，再用緩沖溶液平衡，即可進(jìn)行下一次分析。

對(duì)于玻璃層析柱其方法是：將凝膠從柱柱中取出，將已使用過(guò)的凝膠先用0.2mol/L氫氧化鈉與0.2mol/L氯化鈉混合液浸泡半小時(shí)后，用水洗至中性，再裝柱。

對(duì)于長(zhǎng)期不使用的硅膠其方法是：將洗好的凝膠用50%乙醇浸泡，抽干，然后，依次用75%、95%和無(wú)水乙醇浸泡抽干，最后用乙醚浸泡抽干置37℃烘干后，即可長(zhǎng)期保存。12/10/202272凝膠再生：12/10/2022722.裝柱取層析柱一根，底部用玻璃纖維或砂蕊濾板襯托，并要求濾板下的體積盡可能小。將柱垂直至于鐵架上，然后在柱頂連接一長(zhǎng)頸漏斗（漏斗頸直徑約為柱直徑的一半）。在柱中加水或洗脫液，并趕凈濾板下方氣泡，使支持濾板底部完全充滿液體，然后將柱的出口關(guān)閉。把已經(jīng)溶脹好的凝膠調(diào)成薄漿，從漏斗倒入柱內(nèi)，膠粒逐漸擴(kuò)散下沉，薄漿連續(xù)加入。

12/10/2022732.裝柱12/10/202273裝柱要點(diǎn)：1）凝膠漿濃度應(yīng)適宜（一般為70%水混懸液），分散均勻不結(jié)團(tuán)（不宜強(qiáng)烈攪拌）。2）一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一致，沒有空隙和氣泡。3）通常新裝的凝膠柱用適當(dāng)?shù)木彌_溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖–2000溶液過(guò)柱，觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術(shù)質(zhì)量是否合格，否則，必須重新裝填。12/10/202274裝柱要點(diǎn)：12/10/2022743.加樣

加樣方法：凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時(shí)，關(guān)閉流出口，用滴管加入樣品液，打開流出口，使樣品液緩慢滲入凝膠床內(nèi)。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面持平時(shí)，小心加入數(shù)mL洗脫液沖洗管壁。然后繼續(xù)用大量洗脫液洗脫。

12/10/2022753.加樣12/10/202275加樣量：加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有關(guān)。如果檢測(cè)方法靈敏度高或柱床體積小，加樣量可小；否則，加樣量增大。一般來(lái)說(shuō)，加樣量越少或加樣體積越小(樣品濃度高)，分辨率越高。通常樣品液的加入量應(yīng)掌握在凝膠床總體積的5％～10％。樣品體積過(guò)大，分離效果不好。

12/10/202276加樣量：加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有關(guān)。如果檢測(cè)方法靈敏度4.洗脫加完樣品后，將層析床與洗脫液儲(chǔ)瓶、檢測(cè)儀、及記錄儀相連，根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，預(yù)先估計(jì)好一個(gè)適宜的流速。

凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時(shí)甚至可用蒸餾水。洗脫時(shí)用于流速控制的裝置最好的是恒流泵。

12/10/2022774.洗脫12/10/202277色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)玻璃層析柱：1.裝柱要均勻，不要過(guò)松也不要過(guò)緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過(guò)快，避免因此而壓緊凝膠。但也不要過(guò)慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過(guò)程中，凝膠床高度下降。2.始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。

12/10/202278色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)玻璃層析柱：12/10/202278色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)3.葡聚糖凝膠耐受壓力為0.3兆帕，過(guò)高壓力會(huì)損傷填料性能。4.防止柱長(zhǎng)霉：可用20%乙醇或0.04%疊氮鈉保存。5.防止柱受污染：可用

0.2mol/L氫氧化鈉與0.2mol/L氯化鈉混合液清洗。12/10/202279色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)3.葡聚糖凝膠耐受壓力為0.3兆帕，過(guò)高壓力色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)不銹鋼色譜柱：1.在高于室溫的條件下使用時(shí)，不要在測(cè)量完畢立即停泵，應(yīng)該是繼續(xù)通流動(dòng)相直到色譜柱的溫度低于室溫為止。如果在色譜柱很熱的時(shí)候停泵，當(dāng)流動(dòng)相冷卻過(guò)程中色譜柱就會(huì)進(jìn)入氣泡。12/10/202280色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)不銹鋼色譜柱：12/10/202280色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)2.若色譜柱在短期內(nèi)不再使用，應(yīng)用蒸餾水將含鹽的流動(dòng)相從色譜柱中替換掉，將色譜柱從儀器上取下，擰上塑料堵頭。3.色譜柱長(zhǎng)期不用，應(yīng)在4℃儲(chǔ)藏。若儲(chǔ)藏溫度低于0℃，則會(huì)降低柱效。4.避免陽(yáng)光直射，避免與腐蝕性氣體接觸。12/10/202281色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)2.若色譜柱在短期內(nèi)不再使用，應(yīng)用蒸餾水將含總結(jié)對(duì)抗生素中高分子雜質(zhì)的分析根據(jù)不同品種的特點(diǎn)和不同質(zhì)控要求靈活掌握，優(yōu)先采用凝膠色譜法，但不排除其它驗(yàn)證良好的其它分析系統(tǒng)的應(yīng)用，對(duì)不同品種，視分離情況和分離要求，將SephadexG-10和高效凝膠色譜系統(tǒng)綜合應(yīng)用。12/10/202282總結(jié)對(duì)抗生素中高分子雜質(zhì)的分析根據(jù)不同品種的特點(diǎn)和不總結(jié)高效、快速、簡(jiǎn)便是抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定方法的發(fā)展目標(biāo)，也是必然趨勢(shì)。在2005版中國(guó)藥典中，發(fā)展較為完善的SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)對(duì)多個(gè)品種抗生素高分子雜質(zhì)的控制有著重要的意義。現(xiàn)在已有專門的β-內(nèi)酰胺抗生素聚合物測(cè)定儀，對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素的高分子聚合物檢查方法的研究將起到推動(dòng)作用。12/10/202283總結(jié)高效、快速、簡(jiǎn)便是抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定方法的發(fā)展目復(fù)習(xí)題一、1.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)：對(duì)藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。其分子量一般在1000～5000，個(gè)別可至約10000道爾頓。2.分離度：是指高分子聚合物與藥物單體之間分離程度（或分離能力）。12/10/202284復(fù)習(xí)題一、12/10/202284復(fù)習(xí)題1.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)按其來(lái)源分為：

和

。（外源性雜質(zhì)、內(nèi)源性雜質(zhì)）2.青霉類抗生素高分子雜質(zhì)有

雜質(zhì)和

兩大類。（蛋白（多肽）類雜質(zhì)、聚合物雜質(zhì)）3.青霉類抗生素樣品在儲(chǔ)存過(guò)程中，多肽類雜質(zhì)不斷生成，其反應(yīng)速度與

和

有關(guān)。（水分含量、儲(chǔ)存溫度）4.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)具有

性和

性。5.青霉素的聚合反應(yīng)速度在溶液條件下和

關(guān)系密切；在固體條件下主要和

含量有關(guān)。(溶液的酸堿度、樣品的水分)6.葡聚糖凝膠耐受壓力為

，過(guò)高壓力會(huì)損傷填料性能。(0.3兆帕)7.色譜柱在短期內(nèi)不再使用，應(yīng)用

將含鹽的流動(dòng)相從色譜柱中替換掉，將色譜柱從儀器上取下，擰上塑料堵頭。（蒸餾水）8.色譜柱長(zhǎng)期不用，應(yīng)在

儲(chǔ)藏。若儲(chǔ)藏溫度低于0℃，則會(huì)降低柱效。（4℃）

12/10/202285復(fù)習(xí)題1.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)按其來(lái)源分為：復(fù)習(xí)題1.內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定中影響分離度的因素（ABCD）A．與洗脫劑的組成有關(guān)B．與流動(dòng)相的離子強(qiáng)度有關(guān)C．與流動(dòng)相的PH有關(guān)D．與流動(dòng)相的流速有關(guān)2.當(dāng)流動(dòng)相中的離子種類不改變時(shí)，離子強(qiáng)度越大，β-內(nèi)酰胺類抗生素的Kav值（B）。A.越小B.越大C.不變D.沒有影響3.當(dāng)改變流動(dòng)相的離子種類時(shí)，其Kav值會(huì)隨之變化，決定這種變化的因素是流動(dòng)相中的陰離子種類，陰離子所帶的負(fù)電荷越多，溶質(zhì)的Kav值相對(duì)（B）A.越小B.越大C.不變D.沒有影響4.在色譜過(guò)程中，除分子排阻作用外，凝膠對(duì)藥物分子的吸附作用與對(duì)高分子雜質(zhì)的吸附作用相比（C）A.小于B.等于C.大于D.不一定

12/10/202286復(fù)習(xí)題1.內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定中影響分離度的因素復(fù)習(xí)題1.簡(jiǎn)述影響β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)形成的因素？1)青霉素的聚合物的聚合反應(yīng)速度在溶液條件下和溶液的酸堿度關(guān)系密切；在固體條件下主要和樣品的水分含量有關(guān)。2)頭孢菌素的聚合物固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度的關(guān)系密切。貯存溫度較低時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量盡管有影響，但影響不大；但當(dāng)貯存溫度上升至37℃時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量的影響十分顯著。

12/10/202287復(fù)習(xí)題1.簡(jiǎn)述影響β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)形成的因素？復(fù)習(xí)題2.簡(jiǎn)要說(shuō)明凝膠色譜分離的原理？利用凝膠色譜的分子篩機(jī)制，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。讓藥物分子自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而所有的高分子雜質(zhì)被排阻，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)讓所有高分子雜質(zhì)具有相同的保留時(shí)間的設(shè)想。

12/10/202288復(fù)習(xí)題2.簡(jiǎn)要說(shuō)明凝膠色譜分離的原理？12/10/20228復(fù)習(xí)題3.簡(jiǎn)述影響-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定中分離度的因素？

1）流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)溶質(zhì)保留行為的影響：離子強(qiáng)度越大，β-內(nèi)酰胺類抗生素的Kav值越大。2）流動(dòng)相種類對(duì)溶質(zhì)色譜行為的影響：緩沖液中的陰離子種類，陰離子所帶的負(fù)電荷越多，溶質(zhì)的Kav值相對(duì)越大，色譜峰也越易拖尾。3）流動(dòng)相pH的影響當(dāng)流動(dòng)相中有多元酸/鹽存在時(shí)，pH通過(guò)影響多元酸的解離，改變緩沖液中的陰離子類型，來(lái)改變?nèi)苜|(zhì)的保留時(shí)間。4）洗脫速度的影響流速越大，溶質(zhì)的保留值減小。反之，溶質(zhì)的保留值增大。12/10/202289復(fù)習(xí)題3.簡(jiǎn)述影響-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定中分離度復(fù)習(xí)題4.SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)試驗(yàn)中凝膠的預(yù)處理要求？

1）新使用的凝膠：充分溶脹，室溫20℃需3小時(shí)以上，煮沸需1小時(shí)，凝膠充分溶脹后漂去細(xì)粒。2）已使用的凝膠再生：先用0.2mol/L氫氧化鈉與0.2mol/L氯化鈉混合液浸泡半小時(shí)后，用水洗至中性，再裝柱。

對(duì)于長(zhǎng)期不使用的硅膠其方法是：將洗好的凝膠用50%乙醇浸泡，抽干，然后，依次用75%、95%和無(wú)水乙醇浸泡抽干，最后用乙醚浸泡抽干置37℃烘干后，即可長(zhǎng)期保存。12/10/202290復(fù)習(xí)題4.SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)試驗(yàn)中凝膠的復(fù)習(xí)題5.簡(jiǎn)述凝膠色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)注意事項(xiàng)？

1）葡聚糖凝膠耐受壓力為0.3兆帕，過(guò)高壓力會(huì)損傷填料性能。2）防止柱長(zhǎng)霉：可用20%乙醇或0.04%疊氮鈉保存。3）防止柱受污染：可用

0.2mol/L氫氧化鈉與0.2mol/L氯化鈉混合液清洗。12/10/202291復(fù)習(xí)題5.簡(jiǎn)述凝膠色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)注意事項(xiàng)？12/10/20例題某0.25g青霉素V鉀膠囊的平均裝量為0.3755g，為測(cè)定其聚合物，取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物600.3mg，加pH7.0磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至10ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，立即精密量取200l，注入色譜儀，以pH7.0磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，聚合物峰的峰面積為9528；另精密稱取青霉素V對(duì)照品(青霉素V含量為89.2%)20.02mg，加水溶解并定量稀釋制成100ml，取200l注入色譜儀，以水為流動(dòng)相，同法測(cè)定，其峰面積為32178。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含青霉素V聚合物（青霉素V計(jì)）占標(biāo)示量的百分比。

12/10/202292例題某0.25g青霉素V鉀膠囊的平均裝量為0.3755g式中：C------待測(cè)物濃度At------供試品中待測(cè)物峰面積或峰高Ct------供試品濃度As------對(duì)照品峰面積或峰高Cs------對(duì)照品濃度P------對(duì)照品含量外標(biāo)法12/10/202293外標(biāo)法12/10/202293式中：At------供試品中聚合物峰面積Ct------供試品濃度As------對(duì)照品峰面積Cs------對(duì)照品濃度P------對(duì)照品含量自身對(duì)照外標(biāo)法12/10/202294自身對(duì)照外標(biāo)法12/10/202294=0.088%=0.13%12/10/202295=0.088%=0.13%12/10/202295例題基線積分，峰高：2.2峰谷：0.6問(wèn)：分離度是否達(dá)到要求？12/10/202296例題基線積分，峰高：2.2問(wèn)：分離度是否達(dá)到要求？12/10Thanksforyourattention!12/10/202297Thanksforyourattention!12/1β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定法12/10/202298β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定法12/10/20221第一節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)一、定義β-內(nèi)酰胺類抗生素（β-lactamantibiotics）系指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括臨床最常用的青霉素（penicillins）與頭孢菌素（cephalosporin），以及近年開發(fā)的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等其他非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素。

系對(duì)藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。其分子量一般在1000～5000，個(gè)別可至約10000道爾頓，小于化工、生化領(lǐng)域中所指的高分子化合物的分子量。

12/10/202299第一節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)一、定β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)二、分類及來(lái)源按其來(lái)源分為兩類：外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì)。外源性雜質(zhì)：包括蛋白、多肽、多糖等類雜質(zhì)或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的結(jié)合物。一般來(lái)源于發(fā)酵工藝，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。12/10/2022100β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)二、分類及來(lái)源12/10/2內(nèi)源性雜質(zhì)：抗菌藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程，又可在儲(chǔ)存中形成，甚至在用藥時(shí)使用不當(dāng)也可產(chǎn)生。抗生素聚合物的免疫原性通常較弱，但作為多價(jià)半抗原，可引發(fā)速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。

免疫原性(immunogenicity)：抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。抗原性(antigenicity)：抗原與其誘生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞有特異性結(jié)合的能力。也寫作反應(yīng)原性。

完全抗原：同時(shí)具備2個(gè)性質(zhì)。天然的蛋白質(zhì)都是完全抗原。半抗原(hapten)：只有抗原性而沒有免疫原性的物質(zhì)，即只能與抗體結(jié)合，卻不能單獨(dú)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)，稱為半抗原。一般分子量較小，如化學(xué)藥物。半抗原+載體(carrier)→完全抗原

。

速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)是一種常見的過(guò)敏反應(yīng)，主要為呼吸道過(guò)敏反應(yīng)、消化道過(guò)敏反應(yīng)、皮膚過(guò)敏反應(yīng)以及過(guò)敏性休克。隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高，目前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，對(duì)內(nèi)源性聚合物的控制是當(dāng)前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的重點(diǎn)。12/10/2022101內(nèi)源性雜質(zhì)：抗菌藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程，又圖1水溫引起阿莫西林干糖漿中高分子雜質(zhì)含量的變化12/10/2022102圖1水溫引起阿莫西林干糖漿中高分子雜質(zhì)含量的變化12/β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)三、形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)特征（一）青霉類抗生素：高分子雜質(zhì)有蛋白（多肽）類雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)兩大類。12/10/2022103β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)三、形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)特征12/青霉噻唑多肽：制劑中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在3500～2400道爾頓左右，有青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)和多肽的伯氨基按親核反應(yīng)機(jī)理縮合而成，主要發(fā)生在發(fā)酵工藝中。樣品在儲(chǔ)存過(guò)程中，多肽類雜質(zhì)殘留的自由氨基仍與β-內(nèi)酰胺反應(yīng)，直至被飽和，反應(yīng)速度和樣品本身的水分含量及儲(chǔ)存溫度有關(guān)。12/10/2022104青霉噻唑多肽：12/10/20227青霉噻唑蛋白的基本結(jié)構(gòu)青霉素G內(nèi)酰胺環(huán)斷裂點(diǎn)12/10/2022105青霉噻唑蛋白的基本結(jié)構(gòu)青霉素G內(nèi)酰胺環(huán)斷裂點(diǎn)12/10/20青霉素聚合物：1.反應(yīng)僅和母核結(jié)構(gòu)有關(guān)，側(cè)鏈中的活性基團(tuán)不參與反應(yīng)。一分子青霉素首先開環(huán)，形成一新的活性位點(diǎn)，并與另一分子青霉素聚合。2.側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng)主要以氨芐青霉素為代表，反應(yīng)時(shí)側(cè)鏈上的氨基親核攻擊β-內(nèi)酰胺抗生素的羰基碳原子，形成聚合物。12/10/2022106青霉素聚合物：12/10/20229頭孢菌素：頭孢菌素中的高分子雜質(zhì)主要是不同類型的聚合物。1.只與母核結(jié)構(gòu)有關(guān)的N型聚合反應(yīng)eg.頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮等2.側(cè)鏈參與的L型聚合反應(yīng)。eg.頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻肟等在堿性條件下，兩種反應(yīng)都可以發(fā)生。12/10/2022107頭孢菌素：頭孢菌素中的高分子雜質(zhì)主要是不同類型的聚合物。12β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)四、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)高度的不均一性和不確定性。1.青霉噻唑多肽（蛋白）類雜質(zhì)發(fā)酵中產(chǎn)生的任何蛋白及蛋白碎片都可能帶入到產(chǎn)品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可以結(jié)合不同數(shù)目的藥物分子。12/10/2022108β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)四、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)12/10/202.聚合物類雜質(zhì)：青霉素、頭孢菌素不僅能形成聚合度不同的聚合物，許多樣品還能同時(shí)發(fā)生不同機(jī)理的聚合反應(yīng)。3.形成的聚合物可發(fā)生不同程度的分（降）解反應(yīng)，如開環(huán)等。4.對(duì)以異構(gòu)體形式存在的樣品，同聚和異聚反應(yīng)可同時(shí)發(fā)生。5.實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)高分子雜質(zhì)的種類及數(shù)量和生產(chǎn)工藝密切相關(guān)，如氨芐西林鈉，溶媒法和噴霧干燥法的高分子雜質(zhì)具有不同的特異性，且二者的聚合物含量明顯不同。凍干粉二聚物溶媒粉二聚物12/10/20221092.聚合物類雜質(zhì)：青霉素、頭孢菌素不僅能形成聚合度不同的聚合β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)五、影響聚合物形成的因素1.青霉素的聚合物青霉素的聚合反應(yīng)速度在溶液條件下和溶液的酸堿度關(guān)系密切；在固體條件下主要和樣品的水分含量有關(guān)。

12/10/2022110β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)五、影響聚合物形成的因素122.頭孢菌素的聚合物固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度的關(guān)系密切。貯存溫度較低時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量盡管有影響，但影響不大；但當(dāng)貯存溫度上升至37℃時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量的影響十分顯著。12/10/20221112.頭孢菌素的聚合物12/10/202214β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)六、口服青霉素類藥物使用前進(jìn)行皮試的必要性口服青霉素類抗生素在國(guó)內(nèi)外均有過(guò)敏反應(yīng)報(bào)道，但其原因未有試驗(yàn)報(bào)道。有相關(guān)報(bào)道，在青霉素V聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。因此，在口服青霉素類抗生素前，必須進(jìn)行皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，這是十分必要的。12/10/2022112β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)六、口服青霉素類藥物使用前進(jìn)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)七、抗生素高分子雜質(zhì)的質(zhì)控意義1.β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)是引發(fā)臨床速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原；2.高分子雜質(zhì)經(jīng)注射和口服都可引起過(guò)敏反應(yīng)，因此注射劑和口服劑都應(yīng)控制。3.高分子雜質(zhì)是β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，可評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量和穩(wěn)定性，并可借此進(jìn)一步評(píng)價(jià)其生產(chǎn)工藝。12/10/2022113β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)七、抗生素高分子雜質(zhì)的質(zhì)控意第二節(jié)高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)質(zhì)控方法化學(xué)分析免疫學(xué)分析色譜法分光法（P值法）間接血凝法豚鼠PCA法反相模式離子交換模式凝膠色譜模式一、概述12/10/2022114第二節(jié)高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)質(zhì)控方法化學(xué)分析免由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生物學(xué)特性，如：均為過(guò)敏性雜質(zhì)，因此，在藥物質(zhì)量控制中一般不需分別控制不同結(jié)構(gòu)的高分子雜質(zhì)含量，而只需控制藥品中高分子雜質(zhì)的總量。故根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離的凝膠色譜模式是簡(jiǎn)便易行的分離模式。以葡聚糖凝膠SephadexG-10為基礎(chǔ)的凝膠色譜分析方法，可簡(jiǎn)便地用于對(duì)各種β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的分離、分析，并滿足藥品質(zhì)量控制的需要。12/10/2022115由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生物學(xué)特性，如：均為過(guò)敏高分子雜質(zhì)分析方法二、凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)

12/10/2022116高分子雜質(zhì)分析方法二、凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)12/10凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)1.凝膠色譜法凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。它是利用某些凝膠對(duì)混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進(jìn)行分離、分析的方法。

12/10/2022117凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)1.凝膠色譜法12/10/202凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)2.凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理（1）利用凝膠色譜的分子篩機(jī)制，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。讓藥物分子自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而所有的高分子雜質(zhì)被排阻，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)讓所有高分子雜質(zhì)具有相同的保留時(shí)間的設(shè)想。12/10/2022118凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)2.凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理凝膠滲透色譜按分子大小分離原理圖12/10/2022119凝膠滲透色譜按分子大小分離原理圖12/10/202222凝膠過(guò)濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對(duì)某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數(shù)Kav（被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。

12/10/2022120凝膠過(guò)濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且實(shí)驗(yàn)證明，SephadexG-10凝膠可基本保證所有的β-內(nèi)酰胺抗生素中的高分子雜質(zhì)被排阻。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav:分配系數(shù)；Ve：被分離物質(zhì)洗脫體積；Vo：柱內(nèi)凝膠床中顆粒間自由空間所占有的體積（外水體積）；Vt：柱內(nèi)凝膠顆粒占有的體積與外水體積之和（柱床體積）

一般Kav≈0洗脫的組分視作高分子雜質(zhì)。12/10/2022121實(shí)驗(yàn)證明，SephadexG-10凝膠可基本保證所有的外水體積（Vo）

：凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，即液體流動(dòng)相體積；內(nèi)水體積（Vi）

：凝膠顆粒中孔穴的體積，即固定相體積；基質(zhì)體積（Vg）

：凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。Vt=Vo+Vi+Vg柱床體積（Vt）：凝膠柱所能容納的總體積12/10/2022122外水體積（Vo）：凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，即液體流洗脫體積（Ve）：將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積。一般是介于Vo和Vt之間的。（1）對(duì)于完全排阻的大分子，由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動(dòng)相中，故Ve=

Vo；（2）對(duì)于完全滲透的小分子，由于可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)，故Ve=

Vt；分子量介于兩者之間的分子，其洗脫體積也介于兩者之間，但，有時(shí)也出現(xiàn)Ve＞

Vt，這是由于這種分子與凝膠的吸附作用造成的。12/10/2022123洗脫體積（Ve）：將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積凝膠層析洗脫示意圖（1）完全排阻的大分子（2）中等分子（3）完全滲透的小分子（4）吸附分子12/10/2022124凝膠層析洗脫示意圖（1）完全排阻的大分子（2）中等通常選用藍(lán)色葡聚糖2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。該物質(zhì)分子量大（為200萬(wàn)），呈藍(lán)色，它在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測(cè)（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。但是，在測(cè)定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，不宜用藍(lán)色葡聚糖2000測(cè)定外水體積，因?yàn)樗鼘?duì)激酶有吸附作用，所以有時(shí)用巨球蛋白代替。12/10/2022125通常選用藍(lán)色葡聚糖2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。該物質(zhì)分子Vo的測(cè)定12/10/2022126Vo的測(cè)定12/10/202229Vt的測(cè)定12/10/2022127Vt的測(cè)定12/10/202230（2）由于溶質(zhì)分子和凝膠介質(zhì)間存在多種次級(jí)相互作用，溶質(zhì)分子可被吸附于凝膠介質(zhì)的表面。（3）在凝膠顆粒內(nèi)部具有較大的比表面積和較小的自由空間，故溶質(zhì)分子更易和凝膠介質(zhì)接觸，因此溶質(zhì)分子在凝膠顆粒內(nèi)部較凝膠顆粒外部更易被吸附。（4）即，色譜過(guò)程中除分子排阻作用外，凝膠對(duì)藥物分子的吸附作用大于對(duì)高分子雜質(zhì)的吸附作用。12/10/2022128（2）由于溶質(zhì)分子和凝膠介質(zhì)間存在多種次級(jí)相互作用，溶質(zhì)分子有目的的利用藥物分子和凝膠間的次級(jí)相互作用，使藥物分子吸附于凝膠顆粒內(nèi)表面，進(jìn)而改善高分子雜質(zhì)和藥物分子之間的分離度。（5）在深入研究藥物和葡聚糖凝膠的相互作用及流動(dòng)相對(duì)該相互作用的影響的基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)節(jié)色譜過(guò)程中的流動(dòng)相組成、濃度、pH和流速等參數(shù)，調(diào)節(jié)藥物分子和凝膠顆粒間的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)高分子雜質(zhì)和藥物分子間的分離度。12/10/2022129有目的的利用藥物分子和凝膠間的次級(jí)相互作用，使藥物分子凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)3.

SephadexG-10凝膠色譜法分離β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)的概況：在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中，理論上β-內(nèi)酰胺抗生素三聚體以上的高分子雜質(zhì)均集中在Kav=0的色譜峰中；調(diào)節(jié)各種色譜條件，既可使β-內(nèi)酰胺抗生素的寡聚物（如青霉素類抗生素的二聚物等）和其它高分子雜質(zhì)分離，又可使其二者合二為一，因此可用于不同的分析目的。12/10/2022130凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)3.SephadexG-10高分子雜質(zhì)分析方法三、色譜條件對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中色譜行為的影響12/10/2022131高分子雜質(zhì)分析方法三、色譜條件對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素在Seph色譜條件的影響1.流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)溶質(zhì)保留行為的影響：流動(dòng)相的離子強(qiáng)度和色譜行為雖然并無(wú)直接聯(lián)系，但一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)流動(dòng)相中的離子種類不改變時(shí)，離子強(qiáng)度越大，β-內(nèi)酰胺類抗生素的Kav值越大。

12/10/2022132色譜條件的影響1.流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)溶質(zhì)保留行為的影響：12/在被測(cè)物濃度較高時(shí)，流動(dòng)相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰形和分離效果。有研究表明，在流動(dòng)相中添加中性鹽如氯化鈉或增加緩沖液的濃度后，均使離子強(qiáng)度增加，使β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)得到有效分離。12/10/2022133在被測(cè)物濃度較高時(shí)，流動(dòng)相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰色譜條件的影響2.流動(dòng)相種類對(duì)溶質(zhì)色譜行為的影響：常用流動(dòng)相有：檸檬酸緩沖液、硫酸銨緩沖液、磷酸緩沖液、醋酸緩沖液等。改變流動(dòng)相中緩沖液的種類，可以改變?nèi)苜|(zhì)的色譜行為，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素，表現(xiàn)為其Kav值的改變及色譜峰型的變化。

12/10/2022134色譜條件的影響2.流動(dòng)相種類對(duì)溶質(zhì)色譜行為的影響：12/10流動(dòng)相0.1mol/L頭孢菌素的Kav值頭孢他啶頭孢曲松頭孢噻吩檸檬酸緩沖液0.452.522.06硫酸銨0.361.761.45磷酸緩沖液0.311.361.42醋酸緩沖液0.270.791.00碳酸鹽緩沖液0.210.550.88硝酸鈉0.150.210.58流動(dòng)相中緩沖液種類對(duì)頭孢菌素色譜行為的影響12/10/2022135流動(dòng)相頭孢菌素的Kav值頭孢他啶頭孢曲松頭孢噻吩檸檬酸緩沖液測(cè)定次數(shù)緩沖鹽0.1mol/L理論板數(shù)拖尾因子1磷酸緩沖液31911.43檸檬酸緩沖液23852.542磷酸緩沖液41211.43檸檬酸緩沖液31202.40流動(dòng)相對(duì)頭孢他啶高分子雜質(zhì)色譜行為的影響12/10/2022136測(cè)定次數(shù)緩沖鹽理論板數(shù)拖尾因子1磷酸緩沖液31911.43檸分析證明，影響這種變化的決定因素是緩沖液中的陰離子種類，陰離子所帶的負(fù)電荷越多，溶質(zhì)的Kav值相對(duì)越大，色譜峰也越易拖尾。12/10/2022137分析證明，影響這種變化的決定因素是緩沖液中的陰離子種類，陰離色譜條件的影響3.流動(dòng)相pH的影響

對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。當(dāng)流動(dòng)相中有多元酸/鹽存在時(shí)，pH通過(guò)影響多元酸的解離，改變緩沖液中的陰離子類型，來(lái)改變?nèi)苜|(zhì)的保留時(shí)間。12/10/2022138色譜條件的影響3.流動(dòng)相pH的影響12/10/202241色譜條件的影響4.洗脫速度的影響流速越大，溶質(zhì)的保留值減小。反之，溶質(zhì)的保留值增大。這是由于流速較快時(shí)，溶質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的概率減小，導(dǎo)致與葡聚糖凝膠相互作用的機(jī)會(huì)減少之故。12/10/2022139色譜條件的影響4.洗脫速度的影響12/10/202242色譜條件的影響5.溶質(zhì)保留值和半峰寬的關(guān)系β-內(nèi)酰胺抗生素在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中的半峰寬與其保留時(shí)間均呈線性關(guān)系。也就是說(shuō)，保留時(shí)間越大，半峰寬越大，峰型越難看。12/10/2022140色譜條件的影響5.溶質(zhì)保留值和半峰寬的關(guān)系12/10/202第三節(jié)分子排阻色譜法中國(guó)藥典2005版二部規(guī)定，分子排阻色譜法是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)，其分離原理即為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的測(cè)定采用分子排阻色譜法。12/10/2022141第三節(jié)分子排阻色譜法中國(guó)藥典2005版二部規(guī)定，分子排阻自身對(duì)照外標(biāo)法原理——

在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中，由于SephadexG-10的排阻分子量?jī)H為700道爾頓，因此，除部分寡聚物外，β-內(nèi)酰胺抗生素中的高分子雜質(zhì)在色譜過(guò)程中均不保留；即所有高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，其kav=0。

12/10/2022142自身對(duì)照外標(biāo)法原理——12/10/202245自身對(duì)照外標(biāo)法在特定條件下，β-內(nèi)酰胺抗生素由于分子間的氫鍵、靜電、疏水相互作用等次級(jí)相互作用，可以形成締合物，導(dǎo)致其表觀分子量增大。此時(shí)，在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中和高分子雜質(zhì)具有相似的色譜行為，即在kav=0處表現(xiàn)為單一的色譜峰。12/10/2022143自身對(duì)照外標(biāo)法在特定條件下，β-內(nèi)酰胺抗生素由于分子間的氫鍵自身對(duì)照外標(biāo)法測(cè)定方法——利用以上所述原理，在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中，以藥物自身為對(duì)照品，測(cè)定其在特定條件下締合時(shí)的峰響應(yīng)指標(biāo)；再改變色譜條件，測(cè)定樣品高分子雜質(zhì)和藥物分離后，kav=0處高分子雜質(zhì)的峰響應(yīng)指標(biāo)；按外標(biāo)法計(jì)算，既得藥品中高分子雜質(zhì)相當(dāng)于藥品本身的相對(duì)含量。流動(dòng)相B：水流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液12/10/2022144自身對(duì)照外標(biāo)法測(cè)定方法——流動(dòng)相B：水12/10/20224為什么采用自身對(duì)照外標(biāo)法？定量分析法的理論基礎(chǔ)：通過(guò)檢測(cè)器的物質(zhì)的量與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)成正比，其檢測(cè)器響應(yīng)可以是面積或峰高。含量響應(yīng)值(A或H)定量方法：外標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法峰面積歸一法主成分對(duì)照法12/10/2022145為什么采用自身對(duì)照外標(biāo)法？含量響應(yīng)值定量方法：12/10/2

1.外標(biāo)法以待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照品為參照物，根據(jù)供試品的量和對(duì)照品的量以及對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行定量的方法。

高聚物對(duì)照品較難制備，即使制備的高聚物對(duì)照品由于不穩(wěn)定也較難保存，而且不同批制備的對(duì)照品很難同質(zhì)。β-內(nèi)酰胺抗生素高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性。12/10/20221461.外標(biāo)法12/10/2022492.歸一化法將測(cè)得色譜圖上，所有色譜峰面積求和，與每個(gè)色譜峰面積相比較，即得每個(gè)色譜峰的百分比，把所有的色譜峰的百分比相加即得100%，稱為峰面積歸一化。

對(duì)于高分子雜質(zhì)來(lái)說(shuō)，其含量和藥物本身含量相差甚遠(yuǎn)，測(cè)量誤差較大。12/10/20221472.歸一化法12/10/202250高分子雜質(zhì)樣品主峰12/10/2022148高分子雜質(zhì)樣品主峰12/10/2022513.內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法是結(jié)合了峰面積歸一法和外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)的一種方法，它在加入內(nèi)標(biāo)后，按峰面積歸一法的分析方法進(jìn)行分析，這就避免了由于進(jìn)樣的一致性及樣品歧視效應(yīng)導(dǎo)致的偶然誤差，因而，它的分析精密度也是比較高的，是氣相色譜的一種比較理想的定量分析方法。

12/10/20221493.內(nèi)標(biāo)法12/10/2022524.主成分對(duì)照法由于SephadexG-10凝膠色譜分離系統(tǒng)的柱效較低，進(jìn)樣微量的藥物很難表現(xiàn)出色譜峰。12/10/20221504.主成分對(duì)照法12/10/202253基本分析方法12/10/2022151基本分析方法12/10/202254儀器1.恒流泵1）轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速范圍：0.1-120rpm,正反轉(zhuǎn)可逆

2）調(diào)速方式：無(wú)級(jí)調(diào)速配以線性數(shù)碼旋鈕連續(xù)可調(diào)

3）速度分辯率：30rpm以下為0.1rpm，30rpm以上為1rpm硅膠管

1）粗細(xì)合適2）壁厚1.5mm3）耐磨12/10/2022152儀器1.恒流泵硅膠管12/10/202255儀器2.玻璃層析柱合理選擇層析柱的長(zhǎng)度和直徑，是保證分離效果的重要環(huán)節(jié)，理想的層析柱的直徑與長(zhǎng)度之比一般為1：25～1：100.12/10/2022153儀器2.玻璃層析柱12/10/202256儀器3.檢測(cè)器β-內(nèi)酰胺抗生素通常都有較明顯的紫外吸收特征，所以測(cè)定中一般選擇紫外檢測(cè)器，通常用到的檢測(cè)波長(zhǎng)是254nm。12/10/2022154儀器3.檢測(cè)器12/10/202257儀器3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

積分儀選擇性記錄,進(jìn)行積分處理和定量計(jì)算色譜工作站色譜控制\數(shù)據(jù)采集\記錄\計(jì)算\分析\圖譜保存\實(shí)驗(yàn)結(jié)果編排\打印于一體12/10/2022155儀器3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)積分儀色譜工作站12/10/20225系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.以藍(lán)色葡聚糖2000的保留時(shí)間來(lái)表示高分子雜質(zhì)的保留特征，考察對(duì)照品色譜峰及高分子雜質(zhì)色譜峰與藍(lán)色葡聚糖2000溶液色譜峰保留時(shí)間的比值均應(yīng)不超過(guò)某一限度。

中國(guó)藥典要求是0.93～1.07。對(duì)照品峰和供試品溶液聚合物峰與相應(yīng)色譜中藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時(shí)間的比值也是0.93～1.07。12/10/2022156系統(tǒng)適用性試驗(yàn)12/10/202259流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相B：水5.3495.18612/10/2022157流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相