關于課題多聚酶鏈式反應擴增片段第一頁，共28頁幻燈片脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCT1、DNA的基本單位－脫氧核苷酸一、DNA分子的結構12345O第二頁，共28頁幻燈片鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧核苷酸的種類A腺嘌呤脫氧核苷酸GCT第三頁，共28頁幻燈片第四頁，共28頁幻燈片ATGCAGCT3、DNA分子的平面結構氫鍵5'端3'端5'端3'端第五頁，共28頁幻燈片4、DNA的立體結構

——雙螺旋結構第六頁，共28頁幻燈片2、時間：細胞分裂間期（有絲分裂間期，減數第一次分裂的間期）1、概念：以親代DNA為模板，根據堿基互補配對合成子代在DNA的過程。3、場所：主要是細胞核（其次是線粒體、葉綠體）二．細胞內DNA復制的過程第七頁，共28頁幻燈片4、條件：①模板：親代DNA的兩條母鏈②原料：游離的四種脫氧核苷酸③能量：ATP④

酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對5、過程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的兩條母鏈為模板，根據堿基互補配對規則，合成子鏈。（3）子鏈、母鏈螺旋構成子代DNA第八頁，共28頁幻燈片DNA體內復制（示意）第九頁，共28頁幻燈片6、復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。7、DNA復制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸第十頁，共28頁幻燈片條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子鏈能量ATP不需要引物一般是一小段DNA使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸

1、PCR的技術（DNA體外復制）的條件DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復性（緩慢冷卻）一、PCR的原理（PCR的技術原理）第十一頁，共28頁幻燈片一、PCR的原理（PCR的技術原理）1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復性重復1~3步30輪3、DNA復制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸2、步驟：變性——復性——延伸第十二頁，共28頁幻燈片PCR技術的原理總結利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結合，從而完成體外DAN分子的擴增。體外DNA復制的條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴格控制溫度的溫控設備。復制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。第十三頁，共28頁幻燈片二、PCR的反應過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/第十四頁，共28頁幻燈片5引物15引物2第二次復制第一次復制55

55

5

5模板DNA55

555

5

5525～30次循環（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。第十五頁，共28頁幻燈片每個循環包括：變性——復性——延伸從第二輪循環開始，上一次循環的產物也可以作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合，進行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數擴增。PCR的反應過程總結第十六頁，共28頁幻燈片三、PCR反應的實驗操作1、PCR儀設備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5ml3、微量移液器用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器第十七頁，共28頁幻燈片三、PCR反應的實驗操作（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環程序（反應）循環數變性復性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min第十八頁，共28頁幻燈片四、結果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照調零→測定→計算（公式見P63）波長260nm處讀數蒸餾水做對照50倍第十九頁，共28頁幻燈片（一）理論上DNA擴增數目的計算四、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關第二十頁，共28頁幻燈片2、過程①稀釋2μL

PCR反應液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數調節至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數)×稀釋倍數第二十一頁，共28頁幻燈片50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA

的含量為50g/ml的第二十二頁，共28頁幻燈片體內DNA復制與PCR的技術區別：體內復制PCR技術解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。半保留復制，完全解旋后復制，從模板鏈的一端開始復制。復制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸第二十三頁，共28頁幻燈片課堂小結多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR儀設置工作參數DNA擴增測定含量稀釋調零測定并讀數計算第二十四頁，共28頁幻燈片練習鞏固1、關于PCR技術的應用，錯誤的一項是A古生物學、刑偵破案、DNA序列測定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學CDNA序列測定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定第二十五頁，共28頁幻燈片2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術最突出的優點是A原理簡單B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈活、易于