分子雜交技術分子生物學中用于檢測生物樣本中是否含有特定的生物分子的一門技術。樣品制備電泳雜交轉膜結果顯示探針制備分子雜交原理及流程圖一.分子雜交種類

1.按其分子種類劃分

1）DNA雜交—探針為DNA或RNA

2）RNA雜交—探針為DNA或cDNA3）蛋白質免疫分析—探針為抗體2.按樣品制備過程劃分1）原位雜交(insituhybridization)i.原位菌落雜交ii.原位噬菌斑雜交iii.原位細胞雜交iv.原位組織塊雜交原位裂解細胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質樣品，可同時處理大量樣品，常用于目的基因的篩選或檢測某類細胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質序列。2）斑點雜交(dothybridization)先分離DNA，RNA或蛋白質，然后將樣品液直接點在固體基質上進行雜交，不能測定分子量大小。一.分子雜交種類

1)DNA和RNA的雜交制備DNA或RNA樣品→與固定基質結合→80℃真空固定→預雜交→加入標記探針雜交→洗滌→放射自顯影或顯色反應。

2）蛋白質的免疫分析制備蛋白質樣品→與固定基質結合→常溫空氣中固定→封閉劑封閉→一抗反應→洗滌→二抗-酶偶聯物反應→洗滌→顯色反應（EIA）或→一抗放射標記物→洗滌→放射自顯影（RIA）二、分子雜交的一般程序1.固定基質的種類與特性1）硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulosefilter,NCF)可與三類大分子的結合，其機理不清楚，可能為被動吸附。NCF不能結合小分子DNA，RNA和蛋白質（<20,000）優點：i.用于DNA，RNA雜交分析時結果可靠，靈敏，本底低。ii.用于蛋白質分析時，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要預激活；易于操作缺點：結合低分子蛋白質不穩定，反復使用探針次數有限（2-3次）2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙最大特點是能結合小分子的DNA，RNA和蛋白質，共價結合，可用不同探針進行多次雜交分析。該類基質結合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質時最好用放射性標記物。這類基質對生物大分子是主動吸附。

三、雜交樣品膜的制備

3)尼龍膜i.陽離子尼龍膜

i)容量大,蛋白質可結合480μg/cm2ii)可結合不同大小的DNA，RNA和蛋白質。iii)韌性好iv)可用于電轉移v)可進行反復多次雜交試驗vi)廣泛的化學耐受性和可高溫消毒*不能用于蛋白質的直接染色。ii.尼龍66廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時陽離子狀態轉變為pH7時陰離子狀態，電轉移時要注意。

4）離子膜

i.DEAE-纖維素紙ii.CM-纖維素紙三、雜交樣品膜的制備2.固定基質的選擇依據

1）強度，耐久性，操作簡便2）高信噪比（低本底高信號）3）生物大分子的結合容量和穩定性4）重現性好三、雜交樣品膜的制備i)細胞培養（高密度，幾百—十萬個菌落或低密度，幾百個以下）ii)細菌細胞原位裂解與DNA變性ii.原位噬菌斑雜交樣品膜i)細胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板）ii)噬菌體轉移—用NCF作影印iii)DNA變性與固定（與上同）

ii.毛細管法(Capillaryblottingmethod)Southern印跡v.各種轉移方法的比較i)擴散法和毛細管法：操作簡便，不需要特殊轉移儀器，但轉移效率低,（擴散法為70%，毛細管法80%）耗時多。ii)電轉移法：效率高，耗時少，需特殊轉移儀，對轉移條件要求較嚴。iii)真空轉移法：效率高，耗時最少，需特殊真空轉移儀。vi.轉移的最佳條件i)固定基質的選擇ii)轉移前預處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質則需除去凝膠中的SDS。iii)大分子的轉移

對于分子量較大的DNA片段，必須進行原位斷裂后再進行轉移，斷裂DNA分子最佳長度為1-2kb。其步驟是：0.25MHCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）→水洗→0.5MNaOH/1MNaCl兩次，每次15分鐘→轉移。

對于大分子蛋白質，可采用下述三種方法之一：解偶聯劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉移緩沖液中加入SDS。四.標記探針的制備

1.標記化合物的種類

1）放射性同位素標記物125I，3H，14C用于蛋白質標記；32P，3H，35S 用于核酸標記，其中32P和35S使用頻率高。32P標記核苷酸的α位或γ位，35S則是標記核苷酸的α位.2)非放射性標記物

i.生物素分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白—抗生物素蛋白牢固地結合。每個抗生物素蛋白可結合4個生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結合更牢固，可大大提高其靈敏度。生物素可以經過化學法與不同的化合物結合形成標記化合物。

ii.半抗原包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。地高辛配體是一種脂質半抗原，可將其連在dUTP上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測上述標記物的方法是利用二抗-酶偶聯物反應和顯色反應。iii.蛋白質檢測標記物i)酶偶聯二抗（0.05ng）ii)蛋白質A（來自金黃色葡萄球菌）。可作用于大多數哺乳動物的IgG，靈敏度較低（5ng）iii)免疫金（immunogold）0.1-0.5ng3)兩類標記化合物的比較i.靈敏度i)檢測蛋白質，兩種方法差不多。ii)檢測核酸，放射法比酶法敏感。ii.穩定性酶法探針可在4℃保存一年，放射性標記需每次制備。iii.安全性非放射性標記安全。iv.效率非放射性標記所需時間短。2.標記探針的制備

1）鏈標記法i.切口移位法

ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.隨機DNA引物延伸法

ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P)iii.反轉錄法mRNA+dNTP(32P)→cDNA（標記）iv.轉錄法含有待標記DNA片段的重組質粒+NTP(32P)→→RNA（標記）SP6聚合酶v.引物延伸法含待標記DNA的單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待標記DNA鏈切口移位法（NickTranslation）原理及過程：反應體系中DNA酶I隨機在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口處按5’→3’方向切除單核苷酸；同時DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口處3’端加入底物中的單核苷酸，彌補缺口處的核苷酸鏈。隨著反應的進行底物中被標記單核苷酸，并被隨機摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進行，探針即被標記。NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP

Bio-dNTP隨機引物標記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP變性-復姓

1.核酸雜交與結果檢測1）預雜交：預雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標記探針是cDNA或RNA，預雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結合,42℃4-6h或過夜。2）雜交：探針100℃變性，迅速冷卻，加入預雜交液中，42℃一天五.分子雜交與結果檢測3）洗滌：2×SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計算：T=4GC+2AT

*高強度與低強度雜交：若具高度特異性同源序列，采用高強度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采用低強度雜交條件。這兩種條件之差異表現在雜交液和洗滌液的離子強度以及雜交和洗滌時的溫度。2.蛋白質的免疫分析封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。雜交結果示意圖六、核酸分子雜交實驗因素的優化探針的選擇在大多數情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針或RNA探針長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交探針的標記方法選擇什么標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定；但還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等

一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩定的堿性磷酸酶顯示系統六、核酸分子雜交實驗因素的優化雜交率現代雜交實驗無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進行在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復雜度）和探針濃度。下面列出的公式適用于過剩單鏈探針對靶序列雜交的情形t1/2=ln2/kct1/2半數探針與固定靶序列雜交所需的時間（s）k=形成雜交體的速率常數[mol/(Lxntxs)]決定于探針長度（L）、探針復雜度（N）、溫度、離子強度、粘度和pHc=溶液中的探針濃度（mol/L）六、核酸分子雜交實驗因素的優化雜交最適溫度——雜交技術最重要的因素之一反應溫度低于Tm10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30℃），雖然互補鏈之間也可形成穩定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱最適復性溫度（Optimunmrenaturationtemperature,TOR）：Tor=Tm–25℃苛刻復性溫度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻復性溫度：Tns=Tm–(30或35℃)可以通過使用高濃度鹽溶液（如6.2mol/lNaCl），或使用某些有機溶劑的水溶液降低反應溫度現在認為，適當選擇甲酰胺和鹽水濃度及合適的反應溫度，可使DNA復性和DNA-RNA雜交獲得高特異性和更快的反應速度。六、核酸分子雜交實驗因素的優化雜交的嚴格性影響雜交體穩定性的因素決定著雜交條件的嚴格性。一般認為在低于雜交體Tm值25℃時雜交最佳通過調節鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性在實際應用中，寡核苷酸探針的最佳雜交溫度必須精確確定。最方便的一種方法是制備一張含不同稀釋度靶DNA和非特異靶DNA（如魚精或大腸桿菌DNA）的膜。在不同溫度下使膜與探針雜交，特異靶序列結合探針信號很強，而非特異靶序列與探針無任何反應的溫度就是最適溫度六、核酸分